Science大作深化：旋轉光固化3D打印快速構建復雜活體組織

來源： EngineeringForLife

目前生物3D打印方法包括基于擠出，立體光刻(SLA)和數字光投影打印(DLP/ DMD)等（詳細生物3D打印分類可參考綜述：漫畫生物3D打印Part II：打印方法及工藝） 。這些打印方法都是基于層層堆積（layer-by-layer）來構建三維結構的，通常需要支撐材料來實現中空或懸垂結構的打印，大大限制了復雜結構的精確制造。此外，打印大尺寸組織結構需要很長的時間，這就迫使細胞在墨盒中留存時間過長，大大影響細胞活性。因此，提高打印效率和精度成為生物3D打印工藝研究的熱點和難點。

2019年1月加利福尼亞大學伯克利分校的Brett E.Kelly、Indrasen Bhattacharya、Hossein Heidari在Science上發(fā)表的“Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction”提出一種全新的打印技術，他們開發(fā)了一種計算軸向光刻（CAL）方法，該系統能夠選擇性的固化容器內的GelMA水凝膠（GelMA：甲基丙烯酸酯明膠，EFL可提供標準化的、成系列的GelMA產品），能夠把三維物體分解成為一組二維圖像并從不同的角度投射出來，讓光敏液體固化成所需要的三維形狀。在不同的精度和材料條件下，打印時間僅需30-120秒。該套系統的最高精度可以達到0.3毫米。

圖1 A)三維模型不同角度圖像的投射，B)打印原理，C) CAL打印過程中不同視角，D) 打印成品，E) D的清晰化模型 ，F) D的更大尺寸模型，G)添加紫色染料的F模型

隨后，瑞士洛桑理工學院的 Christophe團隊在CAL方法的基礎上，進一步提出了“高分辨率的層析制造法”技術，極大地提高了打印速度和尺寸范圍。該技術通過將一個圓柱形的樹脂容器設置成旋轉的，一邊有DLP調制器產生的光對容器進行照射，這些光與樹脂容器的旋轉運動同步顯示，在短短幾十秒的時間內就可以實現打印的完成。相關論文“High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing”發(fā)表于“Nature Communications”。

圖2高分辨率層析打印實驗裝置

近期，烏得勒支大學醫(yī)學中心Riccardo團隊，同瑞士洛桑理工學院Christophe團隊合作，在CAL技術的基礎上做出了更進一步深入研究，引入了一種體積生物打印(VBP)的概念，使得在幾秒到幾十秒的時間內制造出具有任意大小和形狀的細胞負載結構，實現了在極短時間內完成生物墨水厘米級的適用于臨床尺寸的精細結構成形，其成果“Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds”發(fā)表于“Advanced Materials”。

研究中針對以上傳統打印中出現的問題引入了體積生物打印(VBP)的概念，VBP技術能在幾秒到幾十秒的時間內制造出具有任意大小和結構的整個細胞負載結構。VBP是受計算機斷層掃描(CT)的啟發(fā)，通過使用二維動態(tài)光場照射，從而制造更為復雜的物體，能夠實現打印產物的分辨率在80um以下。體積打印技術將物體的分層打印變?yōu)橐淮涡詣?chuàng)建整個對象，從而克服了傳統生物打印技術因打印時間過長對細胞造成的損傷，其打印精度也到達了傳統打印方法無法企及的程度，可以打印出解剖學上正確的骨模型以及半月板的植入模型。該研究中的生物墨水被放在圓柱形容器中，以允許其實現空間選擇性交聯。為了實現這種三維空間中的劑量分布，容器被設置成可旋轉的，并與一系列2D光同步照射，通過一個DLP調制器和一個405nm激光光源，這些動態(tài)光被顯示到生物墨水中。

圖3 A)裝載有生物墨水的打印容器連接到一個旋轉平臺上，B)用于打印人體耳廓模型的層析投影示意圖，C)打印出來的水凝膠結構的效果圖

研究中選用GelMA為所打印生物材料，PBS為溶劑，LAP為光引發(fā)劑。由于打印過程中對于打印產物精確性的要求，光引發(fā)劑存在一個濃度上限，簡而言之，在配制生物墨水是要嚴格控制LAP的濃度范圍，使光能夠穿透整個打印結構的同時又必須能使生聚合，同時也要保證LAP毒性對細胞損傷降到最低。為了達到這一目的，光強度值至少要達到入射光強度的37%才能到達打印體的另一側(圖4A)。VBP在精準制造上的能力可見一斑，當通過比較計算機斷層掃描(CT)獲得的打印產物和原始STL文件時，得到打印的人類耳廓模型顯示體積變化僅為5.71±2.31%。與其他打印方法相比打印時間不受打印結構尺寸限制，打印物體放大二倍、三倍后同未進行放大處理的模型用時相同（圖4B），相對于擠出式打印方法、DLP打印方法的打印時間隨著打印模型體積的增大而增大，VBP打印方法占有極強的優(yōu)勢。DLP打印方法可通過減少每層提升時間來加速打印過程，但相對于VBP方法其使用時間也要高出一個數量級。在體積生物打印技術中，只要提供給光敏聚合物相同的輻照強度，打印時間就可以保持一致，而與打印物的體積無關。

圖4  A)生物墨水添加LAP后，光透過整個打印體量的圖形表示，B)使用不同的生物打印技術:VBP、擠出生物打印、DLP，按比例1×(0.15 cm 3)、2×(1.23 cm 3)和3×(4.14 cm 3)制作人耳模型的時間

其次VBP方法打印出的結構不會出現打印痕跡，打印物表面非常的光滑（圖5），在研究中的光學條件下，體積邊緣的分辨率僅為33微米。

圖5 通過(i)VBP打印、(ii)擠出式打印(iii)DLP(標尺= 500微米)打印的耳廓表面特寫圖像

VBP生物打印技術中，不需要犧牲材料就可以打印出懸臂部件。這一特性便于生成能夠可逆地變換打印后形狀的結構，如打印刺激響應材料(通常用于4D打印)結構。利用這一特性，本文設計了一種流體閥，通過懸浮打印從而得到封閉空間內的球體，連接到流體系統時可正常工作（圖6）。使用VBP打印技術可實現對小梁結構和錯綜復雜、相互連接的多孔網絡的制造，超越了傳統基于擠壓的生物打印技術。使用體積打印方法，這些結構被成功地復制，最小的分辨率為144.69±13.55um。

圖6 流體球籠閥的VBP打�。╥）計算機生成的閥門三維模型，（ii）打印閥門俯視圖(scale bar= 2 mm)，（iii）閥體流動的特寫(scale bar=1mm)，（iv）打開狀態(tài)（箭頭代表流動方向），（v）閉合狀態(tài)

使用VBP打印方法時，在室溫下進行打印有利于防止打印過程中的細胞沉積，室溫狀態(tài)下的GelMA生物墨水還為打印結構體提供了穩(wěn)定的定位，避免了因交聯后浮力的潛在變化或生物墨水容器的旋轉而致使的已打印部分的運動。即使在打印其他不像GelMA這樣的黏度隨溫度變化的光固化生物墨水時，由于VBP過程的快速，也可以實現均勻的細胞懸浮。最后,選擇性地交聯生物墨水后,未反應的生物墨水在37°C的環(huán)境下用PBS或水就可以很容易的沖洗掉。VBP生物打印作為一種無噴嘴的方法，不會出現擠出式打印中由于施加剪切應力而產生的細胞損傷和打印形貌破壞。活組織的功能主要歸功于其復雜的結構，對細胞命運起到決定性因素的是細胞外環(huán)境相關形態(tài)和生化信號的精確分布，在這一點上VBP打印方法可以很好的確保外環(huán)境的精確還原。

圖7 VBP打印出的半月板形結構相關評估和新組織形成 A)（i）計算機生成模型,（ii）生物墨水打印樣品體外培養(yǎng)28天 (scale bar= 2mm)，（iii）打印半月板的三維結構的CT掃描，（iv）整個打印過程中，觀察到7天內細胞存活率很高.B)代謝活動在7天內增加.C)新組織形成方面，打印結構中糖胺聚糖生成量的顯著增加，以及在28d培養(yǎng)期間半月板壓縮模量的增加.

綜上所述，本篇文章突出說明了VBP（體積打印）打印方法能夠快速創(chuàng)造大型的、自由形態(tài)的細胞結構，與傳統的生物打印方法相比，打印時間大大減少，并制造高細胞密度的打印物。VBP生物打印的快速性在組織打印和疾病模型研究上具有很大的優(yōu)勢，生成任意形狀的大型組織結構可以幫助患者特異性治療，VBP生物打印技術很可能廣泛應用于組織再生、體外組織和疾病模型研究以及軟機器人技術。


參考文獻：
[1] Kelly B E , Bhattacharya I , Heidari H , et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction[J]. Science, 2019.
[2] Damien Loterie，Paul Delrot，Christophe Moser, High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing[J]. Nature Communications, 2020.
[3] Paulina Nuñez Bernal, Delrot P , Loterie D , et al. Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds[J]. Advanced Materials, 2019.