負(fù)載Mg-Ce-MOF的生物3D打印支架改善衰老微環(huán)境，促進(jìn)老年骨缺損修復(fù)

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

年齡相關(guān)骨缺損因衰老微環(huán)境中高氧化應(yīng)激與過度炎癥，致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老、骨再生能力減弱，是老年人群殘疾與死亡的重要誘因。上海第九人民醫(yī)院王金武教授團(tuán)隊(duì)制備出多功能鎂鈰離子基金屬有機(jī)框架，構(gòu)建3D生物打印支架，通過清除活性氧、持續(xù)釋放鎂離子來(lái)改善衰老微環(huán)境，促進(jìn)老年骨缺損修復(fù)。相關(guān)工作以“Three-Dimensional Bioprinted Scaffolds Loaded with Multifunctional Magnesium-Based Metal?Organic Frameworks Improve the Senescence Microenvironment Prompting Aged Bone Defect Repair”為題發(fā)表在《ACS Nano》上。

研究?jī)?nèi)容
通過掃描電子顯微鏡（SEM）、能量色散X射線（EDX）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和X射線衍射（XRD）等方法，研究了不同金屬有機(jī)框架（MOF）的結(jié)構(gòu)和成分。結(jié)果顯示，Ce-MOF呈均勻棒狀，Mg-MOF為三角形板狀，Mg-Ce-MOF為六方立方結(jié)構(gòu)，且其中鎂和鈰元素分布均勻，證實(shí)了MOF的成功合成及其晶體結(jié)構(gòu)完整性。

圖1. Ce-MOF、Mg-MOF和Mg-Ce-MOF的表征。  

利用流變學(xué)測(cè)試、溶脹比和降解率分析等方法，研究了支架的物理性能和離子釋放情況。結(jié)果表明，含鎂鈰MOF的支架具有良好的溫度敏感性和機(jī)械強(qiáng)度，能持續(xù)釋放鎂離子，且對(duì)過氧化氫（H?O?）的清除效率更高，有效降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。

圖2. 3D生物打印支架的理化性質(zhì)及體外抗氧化能力。

通過SA-β-Gal染色、RT-qPCR和免疫熒光染色等方法，研究了氧化應(yīng)激下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的衰老情況。結(jié)果顯示，含鎂鈰MOF的支架能顯著減少衰老細(xì)胞比例，降低衰老相關(guān)基因（p21、p53）表達(dá)，增加細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）表達(dá)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其能減少ROS和DNA損傷。  

圖3. 不同組負(fù)載BMSCs的體外及體內(nèi)延緩衰老效果。

采用mRNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析方法，研究了氧化應(yīng)激和鎂離子干預(yù)對(duì)BMSCs基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致288個(gè)基因上調(diào)、163個(gè)基因下調(diào)，而鎂離子干預(yù)后126個(gè)基因上調(diào)、75個(gè)基因下調(diào)，涉及衰老、氧化應(yīng)激和骨分化相關(guān)通路。  

圖4. 不同組BMSCs的mRNA測(cè)序結(jié)果。

通過GO和KEGG富集分析、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）和Western Blot等方法，研究了鎂離子的作用機(jī)制。結(jié)果表明，鎂離子通過激活Nrf2信號(hào)通路，促進(jìn)醛脫氫酶3A1（ALDH3A1）表達(dá)，減少細(xì)胞衰老和炎癥因子（TNF-α、IL-6）釋放。  

圖5. Aging+Mg2?與Aging組的mRNA測(cè)序結(jié)果及鎂離子延緩BMSC衰老的機(jī)制。

利用ALP染色、RT-qPCR和免疫熒光染色等方法，研究了支架對(duì)BMSCs成骨分化的影響。結(jié)果顯示，含鎂鈰MOF和SKL2001的支架能顯著提高堿性磷酸酶（ALP）活性，增加成骨基因（Runx2、OPN）表達(dá)，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成。  

圖6. 氧化應(yīng)激下不同組負(fù)載BMSCs的成骨分化情況。

通過免疫熒光染色、RT-qPCR和Transwell共培養(yǎng)等方法，研究了支架對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。結(jié)果表明，含鎂鈰MOF的支架能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎M2型極化，減少促炎因子（TNF-α）表達(dá)，增加抗炎因子（IL-10）表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs成骨分化。

圖7. 巨噬細(xì)胞極化影響及極化巨噬細(xì)胞在BMSC成骨分化中的作用。

采用Micro-CT、H&E和Masson染色等方法，研究了支架的體內(nèi)骨修復(fù)效果。結(jié)果顯示，含鎂鈰MOF和SKL2001的支架能顯著增加新骨體積和骨密度，促進(jìn)骨組織再生，12周后缺損幾乎修復(fù)。  

圖8. 不同組在老年大鼠顱骨缺損模型中的骨修復(fù)結(jié)果。

通過免疫熒光染色方法，研究了支架植入后的成骨、血管生成和巨噬細(xì)胞表型。結(jié)果顯示，含鎂鈰MOF和SKL2001的支架能增加骨鈣素（OCN）表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞（CD31）和平滑肌細(xì)胞（α-SMA）生成，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞（CD163）比例。

圖9. 成骨、血管化和巨噬細(xì)胞極化的組織學(xué)分析。

研究結(jié)論
本研究成功通過水熱法合成多功能鎂鈰金屬有機(jī)框架（Mg-Ce-MOF），并構(gòu)建3D生物打印支架。該支架可有效清除活性氧，減少衰老相關(guān)分泌表型，改善衰老微環(huán)境，延緩負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，促進(jìn)其在氧化應(yīng)激下的成骨分化。同時(shí)，支架能促使RAW264.7細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，改善過度炎癥狀態(tài)。機(jī)制研究表明，鎂離子通過激活Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)醛脫氫酶3A1表達(dá)，從而延緩細(xì)胞衰老。此外，加入Wnt/β-連環(huán)蛋白激動(dòng)劑SKL2001可進(jìn)一步增強(qiáng)支架的成骨分化和巨噬細(xì)胞極化效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，負(fù)載Mg-Ce-MOF、SKL2001和年輕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的3D生物打印支架能有效促進(jìn)老年大鼠顱骨缺損修復(fù)，為年齡相關(guān)骨缺損治療提供了新策略。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.5c03023