浙江大學賀永教授團隊：原位生物3D打印，實現不規(guī)則創(chuàng)傷的原位修復

來源：EngineeringForLife


混凝土通過石子被水泥的浸潤賦予其良好的可打印性及強度，也是建筑3D打印常用材料。受混凝土啟發(fā)，浙江大學機械工程學院賀永教授團隊（EFL團隊），提出了全新的“生物混凝土”墨水思路：將預功能化的載細胞微球作為“石子”，高濃度GelMA水凝膠預聚液作為“水泥”，并開發(fā)了機器人原位生物3D打印系統，實現了對不規(guī)則創(chuàng)傷的原位修復。

▲相關研究“In situ 3D bioprinting with bioconcrete bioink”發(fā)表在Nature Communications期刊上
https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

手術機器人與生物打印相融合
原位生物3D打印系統融合了手術機器人及生物3D打印技術，根據患者組織缺損處的形態(tài)，直接在缺損處沉積治療用生物墨水，實現組織再生及修復。原位生物3D打印有諸多優(yōu)勢，因為應用場景的變化，與常規(guī)生物3D打印相比增加了很多苛刻要求：

打印端環(huán)境多變：原位打印場景中，打印環(huán)境可能是戰(zhàn)場、救災等環(huán)境多變場合，要求墨水流變學性能穩(wěn)定，當打印環(huán)境從低溫到高溫的大溫度范圍變化時不影響打印性能；

• 修復處血水等影響：墨水要能在較高的體溫及充滿血水的浸潤環(huán)境下保持結構不坍塌、打印的細胞能高效存活，并快速功能化以盡快起損傷修復作用；
• 快速功能化：相比于常規(guī)生物3D打印中可以通過長時間灌流進行功能化相比，原位打印需要打印出的組織能快速發(fā)揮急救功能，如何讓打印組織快速功能化是亟需解決的問題；
• 優(yōu)異的粘附性能：打印結構需與缺損組織間形成一定的結合力，防止其在體內修復中脫離缺損，造成二次損傷；
• 急性救治便攜性：墨水適合放入急救包中野外攜帶，用于軍事、消防等高危領域的緊急救助。
  

與常規(guī)生物墨水相比，“生物混凝土”墨水具有如下特點：

• 墨水中的低強度細胞微球與高濃度水凝膠打印后在微觀上類似一系列微球+彈簧，局部低模量，整體高模量，兼具細胞發(fā)育及打印結構形狀維持能力；
• 墨水不是直接使用細胞做原材料，而是經過了培養(yǎng)并具有微組織功能的細胞球，打印后能更快地在受損位置發(fā)揮作用，加速組織修復；
• 墨水具有良好的溫度穩(wěn)定性，在4-37 ℃范圍內均可原位打印；
• 由于墨水主體為穩(wěn)定固化的水凝膠微球，其沉積于血水環(huán)境中也能維持3D形態(tài)；
• 得益于水凝膠預聚液對缺損組織表面的浸潤及氫鍵作用，打印結構的粘附性好；
• 墨水可通過液氮凍存攜帶到野外，有望用于戰(zhàn)場、救災等惡劣環(huán)境下急性救治。
  

圖1 “生物混凝土”墨水的設計思路及使用方式

為了驗證“生物混凝土”墨水在原位打印場景中的適應性，研究人員分別從墨水的流變魯棒性、原位可打印性、復合力學特性、打印體/組織結合力、體內修復能力進行了表征，并設計了緊急救援包使該墨水體系更加便攜。

流變魯棒性：與晶體具有固定的熔點（凝固點）不同，明膠等溫敏型生物墨水基質材料的溶膠/凝膠狀態(tài)受溫度影響極大，這就使其流變性能易受溫度的影響。在流變學表征中，“生物混凝土”墨水呈現Bingham流體特性，并且由于水凝膠微球在墨水體系中的主體地位，使其對大范圍的溫度變化（4-37 ℃）具有高度的魯棒性，可適應原位打印場景復雜多變的環(huán)境情況。

圖2 “生物混凝土”墨水的流變魯棒性

原位可打印性：“生物混凝土”墨水可在擠出端處于低溫、中溫、高溫環(huán)境中時形成均勻的擠出纖維。同時，在沉積端可以發(fā)現，即便傳統墨水在合適的擠出打印溫度中被擠出，但由于接收平臺的溫度過高且充滿“血水”，其迅速過度溶膠化并轉變成一汪液體，喪失了3D結構。而“生物混凝土”墨水由于其主體為穩(wěn)定光交聯的微球，即便在溫度較高和充滿“血水”的接收環(huán)境中，其依然能夠維持良好的3D結構。這證明“生物混凝土”墨水能夠在原位打印中自適應患者損傷處的復雜環(huán)境。

打印體/組織結合力：“生物混凝土”墨水中的“水泥”成分可浸潤缺損組織的微小縫隙，光交聯后可與缺損處組織形成更大的摩擦力，并在氫鍵作用下形成較強的組織結合力，防止打印體脫離患處。

圖3 原位可打印性及打印體/組織結合力

復合力學性能：力學測試與仿真分析結果表明，“生物混凝土”墨水中的低強度水凝膠微球與高濃度GelMA預聚液固化后形成的高強度網絡解決了生物相容性和力學性能間的矛盾，證實了其在原位打印中的力學適應性。

圖4 固化的“生物混凝土”墨水復合力學性能測試及仿真分析

組織修復能力：由于“石子”相是預功能化的細胞微球，打印到創(chuàng)傷位置后有很好的活性，并能快速功能化，4周即可實現大鼠顱骨的有效修復。

圖5 載細胞“石子”的體外存活、伸展、功能化測試

圖6 對顱骨缺損的體內修復能力

便攜性：為“生物混凝土”墨水設計了便攜方案，緊急救援包內包括裝載“石子”組分及“水泥”組分的保溫杯及液氮、移動電源、USB加熱墊、無菌注射器、3D打印噴頭、試劑勺、紙巾等，結合小型機器人打印系統或手動打印模式即可在野外快速進行原位修復手術，使其在未來適用于多場景的現場緊急救援工作。

圖7 裝載“生物混凝土”墨水的緊急救援包

除此之外，實際的臨床案例中患者的組織缺損可由多種原因引起，因而由事故造成的缺損結構形態(tài)及尺寸大相徑庭。為了驗證“生物混凝土”墨水對于不同組織缺損結構的原位打印及修復能力，設置了四種具有不同形狀、不同大小的顱骨缺損大鼠“患者”模型（近似“長方形”、“正方形”、“梯形”、“三角形”為底面的拉伸體缺損模型），作為四名具有不同顱骨損傷形態(tài)并需要原位打印修復的“患者”。

原位打印平臺選用機械臂系統，并將注射泵系統夾持于該機械臂上以實現墨水的恒流量供應。原位打印噴頭選用錐形塑料噴頭。根據大鼠“患者”不同的顱骨缺損3D結構，在“患者”缺損處進行原位打印。待打印結束后，利用405 nm藍光手電筒對墨水進行光固化，最后將“患者”傷口縫合并對傷口消毒。實驗結果表明“生物混凝土”墨水在各“患者”的原位修復中具有高度可行性及修復能力。

圖8 利用“生物混凝土”墨水及機械臂對不同顱骨缺損形態(tài)的大鼠“患者”進行原位修