中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科金榆凱博士發(fā)表 "多細胞 3D 生物打印人膽囊癌,...

膽囊癌 (GBC) 是一種惡性肝膽管癌，具有復(fù)雜腫瘤微環(huán)境 (TME) 和異質(zhì)性的特點。傳統(tǒng)的 GBC 2D 培養(yǎng)模型無法忠實地重現(xiàn)TME的特征。近日，榆凱博士開發(fā)了一種多細胞 3D 生物打印人膽囊癌，用于腫瘤微環(huán)境和瘤內(nèi)異質(zhì)性的體外模擬。該文章名為“Multicellular 3D bioprinted human gallbladder carcinoma for in vitro mimicry of tumor microenvironment and intratumoral heterogeneity”，發(fā)表在Biofabrication 上。本研究基于三維 (3D) 生物打印技術(shù)可以建立高通量和高保真度的多細胞GBC模型，設(shè)計了一個同心圓柱四培養(yǎng)模型來重建腫瘤組織中細胞的空間分布，其中內(nèi)部包含GBC細胞，外環(huán)包含內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的混合物。GBC 3D四培養(yǎng)模型的存活、增殖、生物標(biāo)志物表達和基因表達譜。蘇木精-伊紅(HE)和免疫熒光染色驗證了GBC 3D四培養(yǎng)模型中GBC/內(nèi)皮細胞/成纖維細胞/巨噬細胞生物標(biāo)志物的形態(tài)和穩(wěn)健表達。單細胞RNA測序顯示，模型中GBC細胞有兩種不同的亞型：腺上皮細胞和鱗狀上皮細胞，提示腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的模擬。對各種體外模型的轉(zhuǎn)錄組譜比較分析表明，3D四培養(yǎng)模型中的細胞相互作用和TME將腫瘤細胞的生物學(xué)過程重塑為更具侵襲性的表型。GBC 3D四培養(yǎng)模型恢復(fù)了TME的特征以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，該模型有望在腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開發(fā)中得到應(yīng)用。

一、背景介紹

膽囊癌 (GBC) 是第五大最常見的消化道腫瘤，總發(fā)病率為每100000人3例。它是膽道惡性腫瘤中最常見的癌癥，在所有膽囊切除術(shù)中占0.2% – 3%，在腹腔鏡膽囊切除術(shù)中占 0.09% – 2%。值得注意的是，只有30%的患者在術(shù)前懷疑患有GBC，其余70%的患者是通過術(shù)后病理偶然診斷出來的。GBC具有較高的遠處復(fù)發(fā)率，且尚無公認的最佳輔助治療方法；此外，研究腫瘤發(fā)生、進展和藥物開發(fā)的機制的方法也十分缺乏。值得注意的是，Nepalet al采用了全面的基因組方法來表征GBC并研究與患者生存相關(guān)的分子亞型。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了腫瘤微環(huán)境(TME)和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性在GBC發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。盡管有一項研究旨在通過構(gòu)建患者來源的GBC類器官來探究GBC致癌過程，但成功率不到15%。因此，迫切需要一種能夠模擬TME并重建細胞多樣性、細胞外基質(zhì)(ECM)成分和空間組織的體外模型。

三維生物打印技術(shù)是一種新興的生物工程技術(shù)，將細胞與生物材料混合，精確打印具有復(fù)雜空間排列的人造器官和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。該技術(shù)能夠在體外構(gòu)建具有復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的多細胞三維組織，有助于模擬腫瘤異質(zhì)性和微環(huán)境。近年來，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?？茖W(xué)家已經(jīng)利用3D生物打印制造模擬特定結(jié)構(gòu)和功能的體外組織，以進行機制探索和藥物開發(fā)。

在本研究中的主要目標(biāo)是利用3D生物打印技術(shù)制造具有細胞相互作用和TME的多細胞GBC模型，旨在重現(xiàn)GBC的細胞多樣性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。評估了生物打印組織內(nèi)腫瘤細胞和基質(zhì)細胞的存活率、增殖和腫瘤相關(guān)特征。對2D培養(yǎng)、3D單培養(yǎng)和3D四培養(yǎng)GBC模型進行了基因表達譜比較。預(yù)計該模型將在未來的腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

二、材料與方法
2.1 概念設(shè)計
腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移都發(fā)生在一定的內(nèi)環(huán)境中，即TME。TME是一個由多種成分組成的復(fù)雜系統(tǒng)，包括內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、免疫細胞和ECM。TME在腫瘤的生長、進展和耐藥性中起著重要作用。腫瘤相關(guān)成纖維細胞和浸潤的免疫細胞可以通過細胞因子信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)增殖信號、消除生長抑制、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、參與免疫逃逸和抵抗細胞死亡。許多研究表明，腫瘤細胞可以通過分泌血管生成因子來募集內(nèi)皮細胞，在腫瘤塊內(nèi)形成新生血管網(wǎng)絡(luò)。這些血管具有很強的通透性，因為腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細胞具有較少的緊密連接，并且與基底膜的附著較少。
本研究旨在通過3D生物打印技術(shù)建立體外多細胞組分四培養(yǎng)模型，恢復(fù)組織中不同細胞的空間分布，準(zhǔn)確模擬腫瘤微環(huán)境。理想的3D腫瘤模型包括腫瘤細胞構(gòu)成核心結(jié)構(gòu)，周圍的包膜由成纖維細胞組成，結(jié)構(gòu)中的內(nèi)皮細胞形成微血管供應(yīng)營養(yǎng)和氧氣，免疫細胞散布在血管周圍。根據(jù)這些原理，我們設(shè)計了一個同心圓柱形體外多細胞組分四培養(yǎng)模型(圖1(A))。圓柱體內(nèi)側(cè)包含膽囊癌細胞GBC-SD，外側(cè)環(huán)包含內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的混合物，以模擬包膜組織。我們設(shè)計的單絲直徑為0.3 mm，內(nèi)側(cè)和外側(cè)環(huán)的線距分別為0.4 mm和0.3 mm。內(nèi)筒有8個環(huán)，外筒有4個環(huán)，共堆疊4層，最終高度為1.2mm。

圖 1. 使用基于擠壓的3D 生物打印技術(shù)制造和表征GBC 3D四培養(yǎng)模型。 (A) 3D四培養(yǎng)模型示意圖，其中 GBC-SD 位于內(nèi)筒中，其他三種基質(zhì)細胞位于外部空心筒中； (B) 3D四培養(yǎng)模型的生物打印腫瘤組織的代表性照片。比例尺代表5毫米；(C)細胞在3D四培養(yǎng)模型的生物打印腫瘤組織中形成球形結(jié)構(gòu)。這些圖中表示了比例尺；(D) 7天的3D四培養(yǎng)模型的HE染色。細胞形成球形結(jié)構(gòu)；(E)組織軟化和固定后生物打印組織中不同尺度的照片。

2.1 3D生物打印組織的構(gòu)建

使用兼容雙噴嘴打印的 3D 生物打印機 (ALPHA-CPT1, SUNP BIOTECH) 來制造這些腫瘤組織。將預(yù)熱的12% (w/v) 明膠和4% (w/v) 海藻酸鈉溶液與細胞懸浮液以2:1:2的比例混合，以達到4.8% (w/v) 明膠和0.8% (w/v)海藻酸鈉的最終濃度。3D單培養(yǎng)模型的中心為 1.25×107ml−1 GBC-SD細胞，周圍是沒有細胞成分的生物材料。3D四培養(yǎng)模型具有相同的中心GBC-SD，其周圍是1:1:1的HUVEC、分化的THP-1和CCC-ESF-1混合物，總濃度為0.75×107ml−1 GBC-SD細胞。這些組織是通過逐層強制擠壓制成的。將生物打印組織收集在35 mm培養(yǎng)皿中，立即用100 mM CaCl2處理3分鐘以交聯(lián)海藻酸鈉。然后在3 ml的H-DMEM(補充有 10% FBS、1% 青霉素G和鏈霉素、40 ng ml−1堿性成纖維細胞生長因子和40 ng ml−1血管內(nèi)皮生長因子)中培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。

三、結(jié)果

3.1 3D生物打印組織的構(gòu)建

GBC由多種不同的惡性腫瘤細胞和支持基質(zhì)細胞組成?；颊咧g和腫瘤組織內(nèi)部存在顯著的異質(zhì)性。此外，不同細胞類型之間復(fù)雜的細胞相互作用及其與ECM的相互作用在 GBC的表型多樣性、增殖和進展中起著至關(guān)重要的作用。為了超越傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)皿體外模型利用基于擠壓的3D生物打印平臺構(gòu)建了3D四培養(yǎng)模型，其中的生物材料模擬了腫瘤ECM。這些模型由GBC細胞的腫瘤核心和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的基質(zhì)囊組成。

如前所述，這些細胞類型被組裝成同心圓柱體，產(chǎn)生體外3D四細胞培養(yǎng)模型，其核心由GBC-SD細胞組成，外環(huán)有或沒有基質(zhì)細胞，包括HUVEC、CCC-ESF-1和分化的THP-1。逐層制造后，3D生物打印組織與100 mM CaCl2交聯(lián)3分鐘，以增強模型的穩(wěn)定性。在宏觀尺度上，模型的高度為1.2毫米，內(nèi)半徑和外半徑分別為3.15毫米和4.20毫米。3D生物打印組織的ECM由明膠和海藻酸鈉水凝膠組成，細胞嵌入其中(圖1(A))。明膠是一種由膠原蛋白部分水解而來的蛋白質(zhì)，與體內(nèi)的膠原蛋白同源，是一種生物相容性材料，可以模擬GBC組織中ECM的組成。海藻酸鈉是一種多糖，當(dāng)暴露于氯化鈣(CaCl2)時，會通過形成海藻酸鈣而交聯(lián)。其生物相容性已得到廣泛研究和證實。在優(yōu)化了為評估模型的逼真度和體外細胞存活率，選擇腫瘤核心內(nèi)GBC細胞的濃度為1.25×107 ml−1，外部基質(zhì)組織中細胞的濃度為0.75×107 ml−1。外環(huán)中內(nèi)皮細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞和巨噬細胞的比例為1:1:1(圖1(A))。

3.2 GBC 3D 四培養(yǎng)模型的特征

GBC 3D四培養(yǎng)模型形狀良好，內(nèi)部邊界清晰，這是由于模型內(nèi)細胞濃度不同所致(圖1(B))。將生物打印的組織培養(yǎng)在添加bFGF和VEGF的H-DMEM中，在CaCl2處理3分鐘后，每兩天更換一次培養(yǎng)基，以保持體外模型的結(jié)構(gòu)完整性。生物3D打印組織內(nèi)細胞呈球形結(jié)構(gòu)，體外培養(yǎng)過程中細胞半徑不斷增大(圖1(C))。蘇木精和伊紅(HE)染色顯示了這些組織的結(jié)構(gòu)，顯示出不同的細胞形態(tài)和組織樣細胞密度(圖1(D))。細胞能夠緊密聚集，形成緊密相互作用的球形結(jié)構(gòu)(圖1(E))。

采用Calcein-AM/PI染色來評估這些3D生物打印組織的細胞存活率，通過熒光定量確定準(zhǔn)確的存活率(圖2(A))。對于3D四培養(yǎng)模型和3D單培養(yǎng)模型，在最初7天內(nèi)存活率保持穩(wěn)定。體外培養(yǎng)第7天，3D四培養(yǎng)模型的存活率顯著高于3D單培養(yǎng)模型。在體外培養(yǎng)過程中監(jiān)測生物3D打印組織中的總細胞計數(shù)(圖2(B))。在培養(yǎng)的前3天，3D四培養(yǎng)模型的細胞數(shù)量保持穩(wěn)定，且明顯大于3D單培養(yǎng)模型。然而，3D四培養(yǎng)模型的細胞計數(shù)在7天減少(3.518×105  vs. 5.366×105, p = 0.03)。相比之下，3D單培養(yǎng)模型的細胞數(shù)量保持穩(wěn)定，并在體外培養(yǎng)過程中逐漸增加。這種差異可能歸因于體外培養(yǎng)過程中基質(zhì)細胞數(shù)量的影響以及GBC細胞與基質(zhì)細胞之間的相互作用。

圖2. GBC在3D模型0、3、7、10天時的存活和增殖特征。(A)不同組生物打印組織細胞的活率。通過Calcein-AM/PI染色定量計算活率；(B)不同組生物打印組織細胞總數(shù)；(C)通過CCK8分析測量不同組生物打印組織的細胞活力。 并將第0天的平均活力設(shè)定為100%。這些圖顯示了各組之間的顯著差異。∗p < 0.05,∗∗p < 0.01；(D)顯微鏡下三維四培養(yǎng)模型在3,7和10天的細胞活率。綠色表示活細胞，紅色表示死細胞。

由于存在多種細胞類型，僅測量活細胞率不能完全描述人工腫瘤組織的生長。采用CCK-8測定法評估組織活力(圖2(C))。隨著時間的推移，所有3D生物打印組織的活力都略有下降，僅在第3天觀察到顯著差異。培養(yǎng)7天后，各組織的總活力無顯著差異。通過顯微鏡觀察，隨著時間的推移，活菌率也略有下降(圖2(D))。綜上所述，與3D模型相比，3D四培養(yǎng)模型的存活率和細胞活力顯著提高隨著時間的推移保持穩(wěn)定，而總細胞計數(shù)在7天后發(fā)生變化。因此，選擇生物打印后第7天作為后續(xù)功能實驗的時間點。

3.3 多種細胞類型在GBC 3D四培養(yǎng)模型中存活

為了評估 GBC-SD特異性生物標(biāo)志物的表達，在第7天對GBC 3D四培養(yǎng)模型進行了免疫熒光。一般情況下，3D四培養(yǎng)模型中的GBC-SD細胞對CK7表達呈陽性。此外，GBC-SD 細胞主要保留在內(nèi)筒中，尤其是在邊界處，有幾個膽囊癌細胞遷移到外筒中(圖3(A))。模型中有Ki-67和CK7雙陽性細胞，表明體外培養(yǎng)過程中 GBC-SD 細胞的增殖(圖3(B))。水凝膠解聚后，腫瘤細胞在球體結(jié)構(gòu)中顯示出密切的相互作用(圖3(C))。

圖 3. 第7天GBC 3D四培養(yǎng)模型中GBC-SD 的免疫熒光。(A) 3D 生物打印組織的總體遠景;(B) 3D生物打印組織的微觀視覺;(C)水凝膠解聚后球體結(jié)構(gòu)的照片。對CK7(綠色)和Ki67(紅色)進行熒光染色。DAPI (藍色)是一種細胞核復(fù)染劑。

HUVEC作為3D四培養(yǎng)模型中基質(zhì)細胞的一部分被生物打印到生物打印組織的外筒中。進行CD31免疫熒光染色以評估內(nèi)皮細胞特異性生物標(biāo)志物[圖4(A)]。腫瘤相關(guān)成纖維細胞在腫瘤的存活、增殖和進展中起著至關(guān)重要的作用，顯著影響腫瘤組織的生物學(xué)特性。在3D 四培養(yǎng)模型中使用了CCC-ESF-1細胞，并使用α-SMA染色跟蹤這些成纖維細胞。生物打印組織內(nèi)的成纖維細胞位于外圓柱體中(圖4(B))。為了模擬3D生物打印組織中的復(fù)雜 TME，巨噬細胞被認為是免疫細胞的簡單表示。THP-1細胞廣泛用于體外實驗。這些細胞在生物打印前一天被誘導(dǎo)為M0巨噬細胞。CD68染色顯示，巨噬細胞主要保留在這些組織的外筒中，少數(shù)被極化成CD163表達陽性的M2巨噬細胞(圖4(D))。

圖 4.  第7天 GBC 3D四培養(yǎng)模型中HUVEC、CCC-ESF-1和THP-1的免疫熒光。(A) CD31 (綠色) 染色用于評估內(nèi)皮細胞特異性生物標(biāo)志物。α-SMA (紅色) 染色以區(qū)分成纖維細胞。DAPI (藍色) 是一種細胞核復(fù)染劑。(B) 對α-SMA 進行熒光染色(紅色)。DAPI (藍色) 是一種細胞核復(fù)染劑。(C) 對CD68(綠色)和CD163(紅色)進行熒光染色。DAPI (藍色) 是一種細胞核復(fù)染劑。

3.4 單細胞RNA測序揭示了3D四培養(yǎng)模型中的瘤內(nèi)異質(zhì)性

為了探索腫瘤細胞的異質(zhì)性和TME中不同基質(zhì)細胞的存在，在第7天對GBC 3D四培養(yǎng)模型進行了單細胞測序。經(jīng)過質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)清理，從8983個單細胞獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)?；诮?jīng)典生物標(biāo)志物的表達和t分布隨機鄰域嵌入(t-SNE)分析，成功鑒定了四種不同的細胞類型：上皮細胞(GBC-SD)、內(nèi)皮細胞(HUVEC)、巨噬細胞(THP-1)和成纖維細胞(CCC-ESF-1) (圖 5(A))。四種不同的細胞類型表現(xiàn)出不同的群體，包括187個巨噬細胞、7076個GBC細胞、689個成纖維細胞和1031個內(nèi)皮細胞 (圖 5(B))。每種細胞類型的典型生物標(biāo)志物表達水平如圖 5(C) 所示。此外，GBC 3D四培養(yǎng)模型中的基質(zhì)細胞分別概括了癌癥相關(guān)成纖維細胞、TAM和腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞的譜系特異性標(biāo)志物。這些結(jié)果表明，體外培養(yǎng)后 GBC-SD 細胞是3D四培養(yǎng)模型的主要成分，但TME仍然包含不同數(shù)量的三種腫瘤相關(guān)基質(zhì)細胞類型。

圖 5. 通過單細胞RNA測序鑒定的3D四培養(yǎng)模型中的不同細胞類型和瘤內(nèi)異質(zhì)性。(A) t-SNE 圖在 3D 四培養(yǎng)模型中鑒定了4種細胞類型;(B)顯示了3D四培養(yǎng)模型中分配的4種細胞類型的數(shù)量;(C)小提琴圖顯示了4種不同細胞類型中經(jīng)典生物標(biāo)志物的表達水平;(D) GBC-SD 細胞的 t-SNE 圖鑒定了2種主要細胞亞型，包括鱗狀上皮細胞和腺上皮細胞;(E) 腺上皮生物標(biāo)志物(CDH1 和 TFF1) 的t-SNE 圖，由基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)化強度著色;(F) 鱗狀上皮生物標(biāo)志物(KRT19、CD24、KRT5和KRT15) 的t-SNE 圖，由基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)化強度著色;(G) 小提琴圖顯示了(D)中鑒定的2個不同細胞簇中經(jīng)典生物標(biāo)志物的表達水平;(H) GSVA 圖顯示了鱗狀上皮細胞和腺上皮細胞的標(biāo)志性基因集富集結(jié)果的不同術(shù)語。顯示了使用robust rank aggregation(左圖)以及 AUCell、UCell、singscore 和 ssgsea(右圖)的富集分析結(jié)果。

起源于膽囊粘膜上皮細胞的GBC大致可分為兩種亞型：膽囊腺癌和腺鱗狀細胞癌。通過分析經(jīng)典上皮生物標(biāo)志物的表達，進一步將3D四培養(yǎng)模型中的GBC-SD細胞分為兩個基因表達譜顯著不同的細胞簇(圖 5(D))。在EPCAM+/CDH1+上皮細胞中，角蛋白(包括 KRT19、KRT5 和 KRT15)表達較高的一組被注釋為鱗狀上皮細胞，而另一組分泌蛋白表達較高，以三葉因子(TFF1) 表達為特征，被指定為腺上皮細胞(圖5(E)-(G)).鱗狀上皮細胞主要存在于 GBC 的腺鱗狀細胞癌亞型中，而腺上皮細胞主要存在于膽囊腺癌中。然而，這兩個上皮細胞簇的分布也表現(xiàn)出顯著的患者間和瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，3D四培養(yǎng)模型有效地概括了瘤內(nèi)異質(zhì)性，這可能是由模型內(nèi)GBC-SD細胞的不同空間分布以及與基質(zhì)細胞的相互作用決定的。

為了進一步研究生物打印組織的瘤內(nèi)異質(zhì)性，對GBC細胞的兩個細胞簇進行了 irGSEA。采用了基于單樣本基因表達譜的基因集富集分析方法，包括AUCell、UCell、singscore和ssGSEA。通過不同結(jié)果的RRA，在兩個上皮細胞簇中鑒定了顯著豐富的標(biāo)志。在鱗狀上皮細胞簇中，血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺猬信號傳導(dǎo)、缺氧、TGF-β信號傳導(dǎo)和通過NF-κB的TNF-α信號傳導(dǎo)等10個標(biāo)志物被富集和上調(diào)。在腺上皮細胞簇中，氧化磷酸化的標(biāo)志物富集并上調(diào) (圖5(H))。在腺上皮細胞簇中，AUCell 基因集富集分析鑒定了33個下調(diào)的基因集和12個上調(diào)的基因集;UCell 基因集富集分析確定了39個下調(diào)的基因集和9個上調(diào)的基因集;SingScore 基因集富集分析確定了50個下調(diào)的基因集;ssGSEA鑒定了39個下調(diào)的基因集和8個上調(diào)的基因集(圖5(H))。

3.5 基因表達譜隨細胞組成和組織結(jié)構(gòu)而變化

為了評估和比較這些生物打印組織中的 TME，在第7天對2D培養(yǎng)的GBC細胞、3D培養(yǎng)的GBC細胞和3D四培養(yǎng)的GBC細胞進行了RNA測序。對于3D四培養(yǎng)模型，最初在顯微鏡下從中央核心區(qū)域分離出由GBC-SD細胞組成的腫瘤組織。降解3D生物打印組織后，從多個模型中分離出總RNA，用于后續(xù)測序。評估了這些樣本的RNA測序質(zhì)量，超過90%的基因錯誤率低于0.01%。通過DESeq2鑒定校正P值< 0.05和log2 (倍數(shù)變化[FC])⩾2.5的基因。在基于這些基因生成火山圖之后，滿足−log10 (Padj)⩾17和|log2(倍數(shù)變化[FC])|⩾2.5被認為是DEG。對每組的生物重復(fù)進行測序，根據(jù)主成分分析 (PCA)，同一組的樣品表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性。PCA和DEGs的熱圖都揭示了3D四培養(yǎng)模型、3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間不同的基因表達譜(圖6(A)和(B))。

圖 6. 3D四培養(yǎng)模型中的腫瘤細胞表現(xiàn)出不同的基因表達譜。(A)來自不同模型樣本的主成分分析。y 軸表示主成分 2，其方差比例為30.51%。下面的 x 軸表示主成分1，其方差比例為45.96%。樣本在二維平面上表示為點，它們之間的距離顯示了差異;(B) 顯示3D四培養(yǎng)模型、3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型中DEGs 基因表達水平的熱圖;(C) 3D 四培養(yǎng)模型與 3D 單一培養(yǎng)模型的火山圖上的 DEG 比較。y 軸表示顯著性，即 log10(padjusted)。x 軸表示對數(shù)轉(zhuǎn)換的折疊變化 (FC)，即log2FC。顯著上調(diào)的DEG以紅色顯示。下調(diào)的DEG以藍色顯示，而沒有顯著變化的基因以黑色顯示;(D)與3D單一培養(yǎng)模型的基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫對DEGs的功能注釋。左側(cè)的y軸表示不同的GO術(shù)語。下面的x軸表示單個通路中的DEG數(shù)量。不同的 GO術(shù)語按GO注釋的類別著色。圖 中說明了p調(diào)整后< 0.05的為顯著富集的GO通路;(E) 3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間細胞對趨化因子通路反應(yīng)的基因集富集分析(GSEA)。q= 0.03;(F)參與3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間免疫反應(yīng)通路的細胞活化的GSEA。q= 0.03;(G) 3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間細胞遷移途徑的正調(diào)控的GSEA。q= 0.04。DEGs代表差異表達基因。

3.5.1 3D 生物打印組織中的腫瘤細胞顯示出不同的基因表達譜
與3D單一培養(yǎng)模型相比，在3D四培養(yǎng)模型中共鑒定出582個DEG，包括514個上調(diào)基因和68個下調(diào)基因(圖6(C))。使用基因本體論(GO) 數(shù)據(jù)庫對這些DEGs進行注釋，以評估它們的功能。GO注釋顯示，富集的GO項主要集中在生物過程類別中(圖6(D))。值得注意的是，3D四培養(yǎng)模型的特征是細胞對趨化因子的反應(yīng)、參與免疫反應(yīng)的細胞活化和細胞遷移的正調(diào)節(jié)(圖6(E)–(G))。GO富集分析結(jié)果表明，3D四培養(yǎng)模型中的3種不同基質(zhì)細胞類型對GBC細胞有顯著影響，突出了腫瘤-基質(zhì)細胞相互作用對腫瘤組織生物學(xué)特性的影響。此外，將3D四培養(yǎng)模型與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)模型進行了比較，3D四培養(yǎng)模型中GBC細胞的基因表達譜表現(xiàn)出顯著改變。有464個上調(diào)的DEG和113個下調(diào)的DEG [圖7(A)]。與上述結(jié)果一致，大多數(shù)富集的GO術(shù)語被歸類為生物過程(圖7(B))。具體來說，3D四培養(yǎng)模型在與細胞外結(jié)構(gòu)組織、細胞粘附和細胞因子介導(dǎo)的信號通路相關(guān)的過程中表現(xiàn)出顯著富集(圖 7(C)–(E))。此外，對TME相關(guān)的GO術(shù)語進行了GSVA，例如免疫反應(yīng)、ECM組織和對缺氧的反應(yīng)，所有這些術(shù)語在3D四培養(yǎng)模型中的富集評分都顯著高于3D單培養(yǎng)和 2D培養(yǎng)?？傊?D四培養(yǎng)模型表現(xiàn)出不同的基因表達譜，表明與三種基質(zhì)細胞類型共培養(yǎng)比3D單一培養(yǎng)和2D培養(yǎng)更好的TME復(fù)制。

圖 7.分析3D四培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物以及3D單培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物的DEG。(A) 3D四培養(yǎng)模型與2D 培養(yǎng)模型的火山圖上的DEG s;(B) 3D 四培養(yǎng)模型的GO數(shù)據(jù)庫與2D培養(yǎng)模型的DEGs功能注釋的比較;(C) 3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細胞外結(jié)構(gòu)組織通路的基因集富集分析(GSEA)。q = 0.005;(D) 3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細胞-細胞粘附途徑的 GSEA。q = 0.005;(E) 3D四培養(yǎng)模型和 2D 培養(yǎng)模型之間細胞因子介導(dǎo)的信號通路的 GSEA。q = 0.01;(F) 3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的火山圖上的DEG比較;(G) 3D單一培養(yǎng)模型的GO 數(shù)據(jù)庫與2D 培養(yǎng)模型的DEGs功能注釋;(H) 3D單一培養(yǎng)模型和2D 培養(yǎng)模型之間細胞-細胞粘附途徑的 GSEA。q= 0.007;(I) 3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細胞外基質(zhì)組織通路的GSEA。q = 0.01;(J) 3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的細胞外結(jié)構(gòu)組織通路的GSEA。q= 0.02。DEGs代表差異表達基因。

進一步比較了3D單一培養(yǎng)模型和傳統(tǒng)2D培養(yǎng)系統(tǒng)之間的轉(zhuǎn)錄差異。在該分析中，當(dāng)將3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型進行比較時，發(fā)現(xiàn)540個上調(diào)的DEGs和1527個下調(diào)的 DEGs(圖 7(F))。超過一半的富集GO術(shù)語位于生物過程類別中(圖 7(G))。3D單一培養(yǎng)模型的轉(zhuǎn)錄譜顯示細胞間粘附、ECM 組織和細胞外結(jié)構(gòu)組織等過程的富集(圖 7(H)–(J))。這些結(jié)果進一步證實，3D生物打印顯著增強了細胞-ECM相互作用，部分概括了體內(nèi)的TME。

3.5.2. 3D生物打印模型模擬復(fù)雜的細胞相互作用
腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的相互作用以及細胞-ECM相互作用共同塑造了腫瘤組織的生物行為，每個成分都會影響其他成分。為了了解這些復(fù)雜的相互作用，研究了3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的DEG，以及3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間的DEG，重點關(guān)注交叉的DEG(圖 8(A))。該分析提供了與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)對腫瘤組織生物學(xué)特性影響的更全面視圖。在選定的122個基因集中，GO富集分析顯示，大多數(shù)富集的GO術(shù)語集中在生物過程類別中，包括與細胞外結(jié)構(gòu)組織、上皮細胞遷移和鈣離子隔離調(diào)節(jié)相關(guān)的過程(圖 8(B))。這些結(jié)果表明，腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的相互作用與腫瘤遷移和侵襲有關(guān)，并且這些相互作用可以在3D四培養(yǎng)模型中概括。此外，比較了3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的DEG，以及3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的 DEGs(圖 8(C))。兩組DEG中的286個常見基因揭示了3D生物打印組織中ECM的存在所誘導(dǎo)的改變。3D 生物打印組織中的GBC細胞表現(xiàn)出與細胞生長調(diào)節(jié)、細胞-基質(zhì)粘附和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔相關(guān)的GO術(shù)語的富集[圖 8(D)]。上述結(jié)果表明，3D四培養(yǎng)系統(tǒng)中基質(zhì)細胞和ECM成分的存在顯著影響GBC細胞中的各種生物過程和細胞成分。因此，對于與腫瘤生物學(xué)相關(guān)的研究，例如機制探索和抗腫瘤藥物開發(fā)，選擇包含各種基質(zhì)細胞和ECM成分的模型至關(guān)重要。

圖 8. 3D 生物打印組織模擬復(fù)雜的細胞相互作用，并顯示與不良預(yù)后相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征。(A) 3D四培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEG以及3D四培養(yǎng)模型與3D單一培養(yǎng)模型的DEG之間的維恩分析。圖中說明了基因的數(shù)量;(B)GO數(shù)據(jù)庫在A中識別的常見DEG的功能注釋;(C) 3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEGs 以及3D四培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEG之間的維恩分析。圖中說明了基因的數(shù)量;(D) GO數(shù)據(jù)庫在C中識別的常見DEG的函數(shù)注釋;(E)基于3D四培養(yǎng)模型(與3D單培養(yǎng)模型相比)的基因表達特征，對GDC泛癌 (PANCAN) 隊列患者進行Kaplan-Meier生存分析。根據(jù)特征表達評分，將患者分為“高3D四培養(yǎng)特征”組 (n = 1495) 或“低3D四培養(yǎng)特征” 組 (n = 10011)。采用對數(shù)秩分析進行分析，P < 0.0001;(F) 基于 3D 四培養(yǎng)模型(與 2D 培養(yǎng)模型相比)的基因表達特征對 PANCAN 隊列患者進行 Kaplan-Meier 生存分析。根據(jù)特征表達評分，將患者分為“高 3D 四培養(yǎng)特征”組 (n = 1391) 或“低 3D 四培養(yǎng)特征”組 (n = 10115)。P < 0.0001;(G) 基于 3D 培養(yǎng)模型(與 2D 培養(yǎng)模型相比)的基因表達特征對 PANCAN 隊列患者進行 Kaplan-Meier 生存分析。根據(jù)特征表達評分將患者分為“高 3D 培養(yǎng)特征”組 (n = 5184) 或“低 3D 培養(yǎng)特征”組 (n = 6322)。P < 0.0001。

此外，還使用CCC-ESF-1、分化的THP-1和HUVEC對同質(zhì)3D生物打印組織進行了RNA測序。差異分析顯示，與傳統(tǒng)2D系統(tǒng)相比，3D生物打印組織中的基質(zhì)細胞表現(xiàn)出顯著改變的基因表達譜。具體來說，對于HUVEC，當(dāng)將3D生物打印組織與2D培養(yǎng)模型進行比較時，有19個上調(diào)的DEGs和32個下調(diào)的DEGs。對于分化的THP-1，當(dāng)將3D生物打印組織與2D培養(yǎng)模型進行比較時，有122個DEGs上調(diào)，66個DEGs下調(diào)。對于CCC-ESF-1，當(dāng)將3D生物打印組織與2D 培養(yǎng)模型進行比較時，有249個DEGs上調(diào)，424個DEGs下調(diào)。

3.5.3. 3D 生物打印組織中的腫瘤細胞表現(xiàn)出與不良預(yù)后相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征

為了驗證 GBC 3D 四培養(yǎng)模型的臨床相關(guān)性，利用來自UCSC Xena的GDC PANCAN 隊列進行生存分析。最初，使用GSVA評估了PANCAN隊列中每個樣本的特征評分。然后，我們將簽名評分高的患者與簽名評分低的患者的預(yù)后進行了比較。與對照組相比，目標(biāo)模型(3D 四培養(yǎng)模型或3D單一培養(yǎng)模型)中前50個上調(diào)的基因被指定為GSVA中感興趣的基因集。表現(xiàn)出較高 GSVA 評分的患者被歸類為具有“高簽名評分”。與3D單一培養(yǎng)模型相比，對于3D四培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D 四培養(yǎng)特征評分高的患者預(yù)后明顯更差(p< 0.0001) (圖 8(E))。同樣，與2D培養(yǎng)模型相比，對于3D四培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D四培養(yǎng)特征評分高的患者預(yù)后明顯較差(p< 0.0001) (圖 8(F))。此外，比較了3D單一培養(yǎng)特征對患者預(yù)后的影響。與2D培養(yǎng)模型相比，對于3D單一培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D培養(yǎng)特征評分高的患者預(yù)后明顯較差 (p < 0.0001)(圖 8(G))。

此外，還利用了來自公共數(shù)據(jù)庫 Genomics of Drug Sensitivity in Cancer的數(shù)據(jù)進行藥物敏感性模擬。集成電路50比較了3D Tetra培養(yǎng)物與3D單一培養(yǎng)物、3D Tetra 培養(yǎng)物與2D 培養(yǎng)物以及3D單一培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物特征高表達和低表達的細胞系之間的GBC藥物值。在所有3項比較中，特征的高表達與顯著較高的IC相關(guān)50值 (p < 0.001)。這些結(jié)果進一步證實了腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的相互作用，以及GBC 3D 四培養(yǎng)模型中的細胞-ECM相互作用，可能會影響與腫瘤侵襲、治療耐藥相關(guān)的生物過程和特征，并最終導(dǎo)致較差的預(yù)后。因此，GBC 3D四培養(yǎng)模型可以作為GBC相關(guān)研究的更現(xiàn)實和臨床相關(guān)的平臺。

四、討論

本研究首次成功構(gòu)建3D生物打印的人類多細胞膽管癌組織，該組織在體外模擬TME方面具有巨大的潛力。在設(shè)計這種復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)時，充分考慮了人膽管癌中的腫瘤-基質(zhì)比。腫瘤-基質(zhì)比是指腫瘤組織中腫瘤細胞與基質(zhì)細胞的比例，其截斷值由Mesker等提出為50%。李等根據(jù)腫瘤-基質(zhì)比將51例膽囊癌患者分為兩組?；|(zhì)比例低于50%的患者定義為基質(zhì)貧乏組?；|(zhì)比例大于50%的患者定義為基質(zhì)豐富組。作者發(fā)現(xiàn)，腫瘤基質(zhì)豐富的膽管癌患者總體預(yù)后不良。根據(jù)這些研究的結(jié)果，初步將3D四培養(yǎng)模型中的基質(zhì)細胞比例設(shè)定為約30%。

在確定模型中的間質(zhì)細胞類型時發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞是TME中的關(guān)鍵細胞成分。腫瘤環(huán)境中最突出的免疫細胞類型是巨噬細胞。TAM是腫瘤基質(zhì)中數(shù)量最多的細胞群，約占細胞總數(shù)的30%–50%。成纖維細胞是腫瘤組織中的主要基質(zhì)細胞。在某些腫瘤類型中，腫瘤相關(guān)成纖維細胞可能存在于約50%的腫瘤基質(zhì)中。因此，選擇內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和成纖維細胞作為腫瘤模型的主要基質(zhì)細胞。

根據(jù)不同的細胞類型及其分布情況，分別生物打印了3D四培養(yǎng)模型和3D單聯(lián)培養(yǎng)模型，對比了不同時間點兩組細胞數(shù)量、細胞存活率和細胞活力，發(fā)現(xiàn)只有3D單聯(lián)培養(yǎng)模型的細胞數(shù)量持續(xù)增加，而另一組細胞數(shù)量則在一段時間內(nèi)適度下降后又恢復(fù)到初始水平。造成這種現(xiàn)象的原因可能是在計算細胞數(shù)量時無法區(qū)分每種細胞的具體類型。在四培養(yǎng)條件下，內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞沒有以特定的比例存活，降低了細胞總數(shù)。在后期，腫瘤細胞的增殖彌補了這些細胞數(shù)量的減少

本研究構(gòu)建的3D生物打印組織中的細胞存活率隨著培養(yǎng)時間的增加不斷降低而后恢復(fù)到75%左右，該值低于網(wǎng)格肝癌組織中的細胞存活率(約90%)，但與Amann等構(gòu)建的3D細胞培養(yǎng)體系中非小細胞肺癌細胞與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型的細胞存活率(60%~80%)相近，造成該結(jié)果的原因可能是本研究采用的同心環(huán)結(jié)構(gòu)缺乏3D生物打印組織內(nèi)的通道，從而導(dǎo)致中樞缺氧。缺氧是大多數(shù)實體腫瘤的共同顯著特征，也被發(fā)現(xiàn)與膽囊癌預(yù)后不良有關(guān)。在模型中還發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)特征的上調(diào)，表明TME恢復(fù)得更好。此外，在3D四培養(yǎng)模型中觀察細胞增殖能力時，發(fā)現(xiàn)大量GBC-SD細胞呈Ki-67陽性。在多細胞組織中，成纖維細胞和巨噬細胞可以被標(biāo)記。加入VEGF和bFGF后，內(nèi)皮細胞中CD31表達強烈。這表明多細胞四培養(yǎng)方案是成功的，各種細胞均存活。

通過單細胞RNA測序，成功在3D四培養(yǎng)模型中鑒定了上皮細胞(GBC-SD細胞)、內(nèi)皮細胞(HUVEC)、巨噬細胞(分化的THP-1)和成纖維細胞(CCC-ESF-1)。這四種細胞類型的相對比例與最初的設(shè)計有所不同，可能是因為GBC細胞在體外培養(yǎng)過程中會增殖，而某些基質(zhì)細胞在長期四培養(yǎng)中可能面臨的挑戰(zhàn)，例如PMA誘導(dǎo)的THP-1分化會阻止增殖。因此，在GBC 3D四培養(yǎng)模型中，第7天分化的THP-1細胞的相對百分比較低。利用3D四培養(yǎng)模型，鑒定了兩種不同的GBC細胞簇，它們具有明顯不同的基因表達譜和不同的標(biāo)志富集特征。這兩簇被描述為鱗狀上皮細胞和腺上皮細胞。這些結(jié)果表明，在多細胞四培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。這表明3D四培養(yǎng)模型有效地復(fù)制了腫瘤內(nèi)細胞的多樣性和異質(zhì)性，這可能歸因于模型內(nèi)GBC-SD 細胞的差異空間排列及其與基質(zhì)細胞以及ECM的相互作用。

為了進一步評估這些生物打印組織中的TME，對來自3D四培養(yǎng)模型、3D單元培養(yǎng)模型和2D模型的幾組不同細胞類型的RNA進行了測序。這三種模型中的GBC細胞表現(xiàn)出不同的基因表達譜。GSVA結(jié)果證實，在3D四培養(yǎng)模型中，TME內(nèi)的機械生態(tài)位、代謝微環(huán)境、免疫微環(huán)境和應(yīng)激適應(yīng)微環(huán)境對腫瘤進展有顯著影響。對DEG的進一步探索表明，腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的細胞相互作用可能與細胞外結(jié)構(gòu)組織、上皮細胞遷移和鈣離子隔離調(diào)節(jié)相關(guān)的途徑有關(guān)。同時，3D生物打印引入的腫瘤細胞-ECM相互作用可能與GO術(shù)語有關(guān)，例如調(diào)節(jié)細胞生長、細胞-基質(zhì)粘附和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明3D四培養(yǎng)模型可能比其他體外模型代表更惡性和臨床相關(guān)的表型。利用PANCAN隊列的生存分析進一步證實，3D四培養(yǎng)特征評分高的患者預(yù)后較差。

越來越多的研究強調(diào)了細胞間相互作用以及細胞-ECM相互作用在腫瘤研究中的重要性。傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)和動物模型存在局限性。因此，該領(lǐng)域迫切需要更好的體外腫瘤模型。

五、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了體外可長期存活的多細胞成分的3D生物打印膽囊癌組織。首先，我們的GBC 3D四培養(yǎng)模型是一種具有空間異質(zhì)性的體外模型，由GBC細胞核心和非腫瘤性腫瘤周圍組織組成。該模型可以更精確地表示TME，并可作為強大的研究平臺。另一個優(yōu)勢是，應(yīng)用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建這些模型具有顯著的效率和令人滿意的可重復(fù)性，使模型中的各種細胞類型能夠在保持其生物功能的同時承受長時間的體外培養(yǎng)。此外，GBC細胞(被鑒定為鱗狀上皮細胞和腺上皮細胞)在3D四培養(yǎng)模型中表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。此外，基因表達譜顯示，與傳統(tǒng)的體外模型相比，3D四培養(yǎng)模型更好地刺激了腫瘤組織的生物學(xué)行為，并提示了更惡性的腫瘤表型。該模型有望在未來腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

六、參考文獻

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