3小時打印窗口+自由基清除！《AM》報道3D打印水凝膠

來源：EngineeringForLife

3D生物打印作為組織工程與增材制造交叉領域的前沿技術，致力于構建具有生物活性的功能化結構。該技術通過將活細胞整合至生物墨水，結合精密沉積系統(tǒng)，可實現(xiàn)具有高度幾何保真度的復雜組織構建。其核心優(yōu)勢在于能夠逐層精準沉積生物墨水，形成可植入組織或高仿真生物模型，目前已在皮膚、血管網(wǎng)絡、神經組織、軟骨及骨骼模型等組織工程領域獲得廣泛應用。3D生物打印技術架起了組織工程與增材制造之間的橋梁，但開發(fā)兼具理想生物特性和物理性能的生物墨水仍面臨挑戰(zhàn)。透明質酸（HA）因其優(yōu)異的生物相容性和細胞識別特性成為極具潛力的基材。

來自瑞典烏普薩拉大學的Oommen P. Varghese團隊通過在半胱氨酸修飾的HA中引入動態(tài)二硫鍵交聯(lián)機制，設計出能在生理pH條件下成膠的HA基生物墨水。針對二硫鍵交聯(lián)水凝膠固化速度慢的固有缺陷，創(chuàng)新性添加碘化鉀（KI）實現(xiàn)濃度依賴型凝膠加速——KI在維持水凝膠結構完整性的同時，不僅顯著提升固化效率，還賦予材料自由基清除能力。當KI濃度控制在50 mM時，墨水可獲得超過3小時的打印窗口期，既能保障細胞存活率，又可支持超細針頭（32G，內徑108微米）打印作業(yè)，從而成功構建出尺寸超過3厘米的復雜3D結構。應用該墨水構建的骨關節(jié)炎疾病模型，首次揭示了人間充質基質細胞（hMSCs）對炎癥環(huán)境下軟骨細胞的免疫調節(jié)作用。這項研究攻克了3D生物打印中的關鍵技術瓶頸，為創(chuàng)新體外模型構建提供了可靠平臺，對疾病建模和精準醫(yī)學發(fā)展具有重要推動作用。相關工作以題為“Ultra-Fine 3D Bioprinting of Dynamic Hyaluronic Acid Hydrogel for in Vitro Modeling”的文章發(fā)表在2025年05月13日的期刊《Advanced Materials》。

【半胱氨酸修飾透明質酸水凝膠的合成與表征】
為開發(fā)自交聯(lián)生物墨水，本文基于二硫鍵化學設計反應體系——該反應可在生理pH條件下進行，但反應速率有待提升。為此，本文合成了半胱氨酸修飾的透明質酸（HA-Cys）。具體方法為：采用碳二亞胺偶聯(lián)化學，以N-羥基苯并三唑（HOBt）為親核催化劑，通過質量源于設計（QbD）優(yōu)化方案（圖1a），在pH 4.7條件下選擇性修飾酰肼末端，保留氨基游離狀態(tài)，最終獲得半胱氨酸修飾的生物聚合物。通過核磁氫譜中對應次甲基（─CHNH₂，4.22 ppm）和亞甲基（─CH₂SH，2.76 ppm）的質子信號驗證修飾度，并采用Ellman法進一步確認化學修飾度為10%。該方法利用5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）的氧化性二硫鍵與游離巰基反應，生成5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）和混合二硫化物。該修飾度被證實為最優(yōu)值：過低會導致水凝膠強度不足，過高則可能改變細胞-材料相互作用。

圖1 透明質酸（HA）修飾與水凝膠形成示意圖

【KI對HA-Cys水凝膠流變特性及抗氧化活性的影響】

為探究KI催化巰基氧化的作用機制，本文通過流變儀時間掃描測試分析了不同KI濃度下的凝膠動力學。以儲能模量（G′）和損耗模量（G″）的交點作為凝膠點，標志材料從流體行為轉變?yōu)閺椥阅�膠行為。如圖2a所示，KI濃度顯著影響凝膠動力學：添加50 mM KI使HA-Cys溶液的凝膠時間從67.3分鐘縮短至11.7分鐘；當KI濃度升至250 mM時，凝膠速度過快（<1分鐘）而無法通過流變測試捕捉（不同KI濃度下的G′/G″交點參見圖S2-S7）。這些數(shù)據(jù)明確證實：KI能在室溫及生理pH下氧化HA-Cys的游離巰基，且二硫鍵形成速率與KI濃度呈正相關。

通過振幅掃描測試進一步評估KI對完全交聯(lián)水凝膠力學性能的影響。圖2b顯示，KI的添加并未顯著改變凝膠剛度，但250 mM KI組出現(xiàn)明顯軟化現(xiàn)象。具體而言，含25 mM KI的HA-Cys水凝膠G′為4005±504 Pa，而KI濃度提升至250 mM時，G′降至2455±684 Pa。這種力學性能下降源于高濃度KI導致的過快交聯(lián)——不均勻的快速交聯(lián)會降低網(wǎng)絡密度，這與我們前期研究結論一致：通過鹽類調節(jié)腙鍵/肟鍵交聯(lián)動力學時，過快的凝膠速率會導致材料剛度下降。

圖2 碘化鉀（KI）對凝膠形成動力學、流變特性及抗氧化活性的影響

【不同濃度KI的HA-Cys水凝膠細胞活性評估】

為評估不同濃度KI的HA-Cys生物相容性，本文進行了活/死細胞染色實驗。實驗將人軟骨細胞封裝于具有最強清除活性的三種KI濃度（50、100和250 mM）HA-Cys水凝膠中，并以不含KI的HA-Cys作為對照組。圖3a展示了培養(yǎng)1天和3天后各水凝膠的活/死染色顯微圖像，其中綠色標記活細胞，紅色標記死細胞。通過ImageJ軟件計算活細胞占比（圖3b）發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)1天后所有水凝膠均保持高細胞活性（>90%）；培養(yǎng)3天后，不含KI與含50 mM KI的HA-Cys水凝膠仍保持>95%的高活性，而100 mM KI組活性降至≈88%，表明存在一定毒性；當KI濃度升至250 mM時，細胞活性急劇下降至31%。

為驗證上述結果，本文采用Presto Blue檢測評估細胞代謝活性。封裝1天后各組無顯著差異（圖3c），但在250 mM KI高濃度下，3天和7天后的代謝活性分別顯著降至39±15%和35±14%。值得注意的是，50和100 mM KI組在這些時間點未出現(xiàn)明顯代謝活性變化。為進一步精確評估低于250 mM KI的細胞毒性，我們檢測了封裝4天后培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量（細胞損傷標志物）。如預期所示，250 mM KI水凝膠毒性最高，而50 mM KI組的LDH釋放量最低（20.4%），甚至優(yōu)于100 mM KI組（33.8%）。綜合其低細胞毒性、優(yōu)異自由基清除能力和顯著加速凝膠形成的特性，本文最終選擇含50 mM KI的HA-Cys（HA-Cys.KI）作為最優(yōu)配方進行后續(xù)分析。

圖3 不同濃度碘化鉀（KI）對封裝細胞活性的影響

【水凝膠在不同條件下的溶脹與穩(wěn)定性研究】

由于水凝膠的穩(wěn)定性和溶脹行為是設計生物墨水的關鍵參數(shù)，本文首先測定了37℃ PBS中水凝膠30天內的溶脹率。令人欣慰的是，含KI與不含KI的兩種水凝膠溶脹程度有限——前6天僅溶脹10%（圖4a）。第9天時，HA-Cys和HA-Cys.KI的溶脹率分別增至18.8±4.6%和24.4±1.1%，第14天時進一步達到37.4±9.9%與35.4±11.6%，此后在整個實驗周期內保持平衡狀態(tài)。

接下來本文評估了透明質酸水凝膠的酶降解特性。已知HA在體內普遍存在的透明質酸酶作用下會發(fā)生降解，該酶能催化HA骨架中β-1→4糖苷鍵的斷裂。這種酶存在于皮膚、眼睛、肝臟、腎臟等多個器官以及血液、淚液等體液中，還能一定程度分解結締組織中的其他粘多糖。因此，本文在37℃富含透明質酸酶的培養(yǎng)基中考察了含/不含KI的HA-Cys水凝膠穩(wěn)定性（酶濃度≈人血漿濃度的40倍）。以初始凝固時水凝膠質量（零時間點）為100%基準，監(jiān)測重量變化百分比。實驗顯示，所有水凝膠在孵育前6小時均顯著溶脹，并在10天內持續(xù)膨脹（圖4b），隨后進入劣化階段，至第14天實驗結束時完全崩解。兩種凝膠（HA-Cys與HA-Cys.KI）的降解曲線無顯著差異，表明添加50 mM KI不會影響水凝膠的穩(wěn)定性與降解特性。

圖4 碘化鉀（KI）在半胱氨酸修飾透明質酸（HA-Cys）水凝膠中對穩(wěn)定性、剪切稀化和自修復性能的作用

【KI對HA-Cys水凝膠中干細胞行為的影響】

水凝膠基質封裝細胞會顯著改變其力學性能和降解動力學，這種變化源于細胞分泌的金屬蛋白酶和培養(yǎng)基中可溶性因子對生物聚合物穩(wěn)定性、交聯(lián)結構及粘彈性的影響。為評估KI對hMSCs相容性的作用，本文進行了活/死細胞染色。圖5a的共聚焦3D圖像顯示，兩種水凝膠中的細胞均呈現(xiàn)均勻分布且具有良好生物相容性。

通過封裝后1、3、7、14天的活/死細胞染色（圖5b）發(fā)現(xiàn)，各時間點兩種水凝膠均以綠色活細胞為主，證實50 mM KI的HA-Cys水凝膠具有良好生物安全性。定量分析顯示（圖5c），7天內細胞存活率均超過90%，14天后輕微下降至略低于90%。細胞密度檢測（圖5d）表明：封裝首日，含KI與不含KI水凝膠的細胞數(shù)分別為507±44和493±74個/mm²，7天后降至≈320個/mm²，14天后減少超半數(shù)。這種動態(tài)變化揭示了細胞與基質間的生物活性互動，以及hMSCs的漸進釋放現(xiàn)象。

圖5 碘化鉀（KI）在半胱氨酸修飾透明質酸（HA-Cys）水凝膠中對hMSCs行為及水凝膠降解的影響

【HA-Cys.KI水凝膠的3D打印潛力】

本研究的核心目標是通過優(yōu)化凝膠動力學時間窗來實現(xiàn)3D生物打印。為此，本文探索了HA-Cys.KI水凝膠作為生物墨水在干細胞遞送和體外模型構建中的應用。針對擠出式3D生物打印分辨率不足的固有局限，本文選用內徑159 µm的30G針頭，根據(jù)水凝膠黏度將壓力設置為250 kPa，在pH調整后60、90、120、150及180分鐘分別打印10 mm×10 mm×1 mm的矩形棱柱模型（填充率40%）。通過Hoechst核染色熒光成像可見（圖6a），HA-Cys.KI水凝膠具有60-180分鐘的寬泛打印窗口，而純HA-Cys水凝膠因凝膠動力學過慢無法滿足打印需求。

打印精度評估顯示（圖6b）：60分鐘時因黏度過低導致纖維流動和邊緣圓鈍，形狀保真度不足設計的50%；隨著時間延長，150分鐘和180分鐘打印的結構精度顯著提升（保真度分別達74±7%和86±4%），孔徑增大表明形狀保持能力增強。高倍熒光圖像（圖6c）揭示纖維尺寸隨時間遞減——60分鐘時約400 µm，180分鐘時降至200 µm（圖6d），這種與凝膠黏度正相關的特性確保了打印后結構的均一性和細胞均勻分布。

圖6 含碘化鉀（KI）的半胱氨酸修飾透明質酸（HA-Cys.KI）水凝膠的3D生物打印優(yōu)化

【超精密3D打印對軟骨細胞與hMSCs的影響研究】

為驗證生物墨水通過細針注射輸送不同尺寸敏感人類細胞并保持其完整性的潛力，本文采用32G針頭進行細胞注射。既往研究表明，細胞在通過注射針頭時會承受機械剪切力和拉伸力，可能導致細胞膜損傷。當細胞懸浮于生理鹽水或細胞培養(yǎng)基等低粘度溶液時，這種損傷效應更為顯著。本實驗選取尺寸較大（約20-50μm）的hMSCs和較小（約10-20μm）的人源軟骨細胞，經熒光標記后封裝于含50mM KI的HA-Cys水凝膠中。如圖7a所示，兩種細胞均能通過32G針頭成功打印，既可單獨打印也可在不同纖維中并行打印。細胞在打印纖維內分布均勻，證實了載細胞水凝膠的均質包封性和可打印性。

為評估水凝膠在擠出后維持細胞存活的效果，本文以常規(guī)培養(yǎng)基作為對照載體，在相同壓力條件下通過32G針頭進行3D生物打印。采用比色法檢測LDH釋放量以量化細胞膜損傷程度。LDH釋放實驗顯示（圖7b），hMSCs在兩組中均表現(xiàn)出比軟骨細胞更顯著的膜完整性損傷�？傮w而言，無論采用水凝膠還是培養(yǎng)基，hMSCs的存活率均低于軟骨細胞，這可能與其較大尺寸導致的膜易損性相關。但數(shù)據(jù)表明，水凝膠對兩種細胞的保護作用顯著優(yōu)于培養(yǎng)基：注射水凝膠時軟骨細胞存活率超過90%，而培養(yǎng)基組僅約50%；hMSCs的差異更為突出，水凝膠組存活率達52±6%，培養(yǎng)基組僅9±3%。這些發(fā)現(xiàn)印證了水凝膠在3D打印過程中對抗剪切損傷和失巢凋亡的優(yōu)越性能，與我們前期關于HA基生物墨水提升干細胞存活率的觀察結果一致。

圖7 兩種不同細胞類型的3D生物打印及打印過程對細胞活性的影響

【體外組織與疾病模型的3D生物打印】

具有高形狀保真度和精確細胞分布的3D打印組織模型，為開發(fā)復雜且具有生物學相關性的體外模型提供了平臺，使研究者能夠在3D環(huán)境中深入探究細胞間相互作用。為此，本文研究了人骨髓間充質干細胞（hMSCs）與軟骨細胞在3D打印體外模型中的遷移行為。實驗中，我們將空心圓柱體（含細胞或不含細胞）直接打印于培養(yǎng)板中，隨后在其空心區(qū)域填充不含細胞或含細胞的水凝膠（圖8a）。為構建不同細胞分布的3D模型，本文設計了三種方案：1）模型1：打印封裝軟骨細胞的空心圓柱凝膠，中心腔填充無細胞凝膠；2）模型2：先打印無細胞空心圓柱，中心腔填充含hMSCs的生物墨水；3）模型3：打印多細胞復合體——空心圓柱含軟骨細胞，中心腔填充含hMSCs的生物墨水。

盡管生物墨水中hMSCs與軟骨細胞的密度相同，但構建模型所需的空心圓柱與中心腔體積存在差異。通過DiL（紅色）和DiO（綠色）熒光染料分別標記hMSCs與軟骨細胞，我們追蹤了7天培養(yǎng)期內細胞的實時遷移（圖8b）。結果顯示：模型1中，軟骨細胞在第2天開始向中心遷移，第3天即填滿無細胞區(qū)域；模型2的hMSCs遷移延遲至第7天；模型3則呈現(xiàn)hMSCs在第5天向軟骨細胞的單向遷移，而軟骨細胞向hMSCs的遷移受限。ImageJ量化分析進一步證實（圖8c），hMSCs的存在會抑制軟骨細胞遷移，但hMSCs自身受軟骨細胞趨化因子驅動定向遷移——這與骨關節(jié)炎患者關節(jié)滑膜中移植hMSCs向軟骨細胞遷移以促進組織修復的臨床現(xiàn)象高度吻合。

圖8 體外模型的3D生物打印

【總結與展望】
本研究開發(fā)了一種新型仿細胞外基質（ECM）生物墨水，通過半胱氨酸修飾透明質酸（HA-Cys）的單組分體系，以KI為催化劑優(yōu)化凝膠動力學，顯著提升了生物墨水的性能。這種二硫鍵交聯(lián)水凝膠具有精準的凝膠動力學、剪切稀化特性及打印后形狀保真能力，其雙重降解性（受封裝細胞類型與密度調控）進一步增強了適用性。該單組分體系支持干細胞、癌細胞、免疫細胞等多細胞類型的可定制化封裝，為研究復雜細胞互作與疾病建模開辟了新途徑。

參考資料：https://doi.org/10.1002/adma.202500315