FAMU-FSU工程學院化學與生物醫(yī)學工程系教授團隊，采用擠出式生物打印技術，發(fā)表人工細

3D 3D2DFAMU-FSUSubramanian RamakrishnanJamel Ali”，發(fā)表在 。結果表明，水凝膠表現(xiàn)出剪切稀化行為，并且細菌濃度增加到對水凝膠前驅體模量和低剪切粘度沒有顯著影響。然而，將細菌濃度提高到顯著降低水凝膠剪切粘度和模量。利用基于擠出的生物打印，最佳打印參數(shù)在天的孵育期內對細菌活力的影響最小。此外，隨著時間的推移，較低濃度的細菌比細胞濃度較高的水凝膠形成更大的聚集體?？傊?，生物膜生長取決于初始細菌密度和基質剛性影響。進一步開發(fā)物理化學調整的生物打印細菌群落將有助于了解其環(huán)境中的細菌相互作用，并為構建包含生物膜的體外組織模型用于高通量藥物篩選提供技術支撐。

一、背景介紹

傳統(tǒng)生物膜研究多在瓊脂等平面基底上進行，揭示了基底剛度等因素對形態(tài)的影響。然而，這些模型無法模擬慢性感染中常見的、嵌入3D環(huán)境(如軟組織)的生物膜特性及其增強的耐藥性。早期將細菌封裝在3D水凝膠(如海藻酸鹽)中的研究顯示出更高的生理相關性，但仍受限于營養(yǎng)/氧氣梯度問題。

二、材料和方法

3.2 封裝細菌濃度的影響

將不同濃度(1×105至1×1010CFU/mL)的鼠傷寒沙門氏菌封裝入兩種藻酸鹽-明膠水凝膠前體(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中，并在25°C下評估細菌負載量對其粘彈性的影響。結果表明(圖3)，細菌濃度≤1×107CFU/mL時，對兩種水凝膠的模量(G'和G'')均無顯著影響。然而，濃度達到1×1010CFU/mL時，兩種水凝膠的模量均顯著下降。該極高濃度下的細菌濃縮物本身(S. Paste)表現(xiàn)出類似彈性固體的行為，其模量遠高于純水凝膠，表明其顯著改變了水凝膠的微觀結構。細菌濃度較低時，水凝膠的剪切稀化行為保持不變。但在高濃度(1×1010CFU/mL)下，剪切稀化效應增強。純細菌濃縮物的流變行為則與純水凝膠相似，均表現(xiàn)出剪切稀化特性。

圖3. 包埋不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的水凝膠前驅體流變特性。

3.4 細菌濃度對存活率與生物膜形成的影響

封裝于兩種水凝膠(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中的鼠傷寒沙門氏菌在4天培養(yǎng)期內均表現(xiàn)出高存活率(>80%)，且兩者間無顯著差異(圖5c,d)。菌落大小受初始細菌濃度和水凝膠剛度共同影響，低初始濃度(1×105CFU/mL)形成的微菌落顯著大于高濃度(1×107CFU/mL)，例如在5%LA-5%Gel中，低濃度菌落第4天平均面積(30,339 μm2)比高濃度菌落大了約4個數(shù)量級(圖6c)。同時，較硬的5%LA-5%Gel(模量~4.7kPa)中的平均菌落面積也大于較軟的1.5%MA-5%Gel(模量~2.7kPa)，但低濃度導致更大菌落的趨勢在兩種凝膠中均一致(圖6c)。菌落形態(tài)(圓度)主要受初始濃度影響，高濃度(1×107CFU/mL)的聚集體在前3天表現(xiàn)出更高的圓度值(更接近圓形)(圖6f,g)。菌落發(fā)展過程表現(xiàn)為，培養(yǎng)初期(第0天)為分散單細胞(圖7)，4天后發(fā)育成大型密集菌落。值得注意的是，微菌落更大的5%LA-5%Gel水凝膠降解更快，導致其打印結構在4天內解體，而1.5%MA-5%Gel結構保持較好。

圖5. 隨時間變化水凝膠打印結構中細菌的存活情況。

圖6. 5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel水凝膠打印結構中細菌聚集體的形態(tài)變化與發(fā)育過程。

四、實驗討論

本研究明確了細菌濃度對藻酸鹽基水凝膠的關鍵影響。初始濃度≤1×107CFU/mL時，水凝膠流變特性和可打印性(基于擠出)幾乎不受影響。然而濃度>1×107CFU/mL會顯著增強剪切稀化行為并降低打印分辨率，強調了精確控制細菌負載量對維持生物打印所需流變性能的重要性。在3D受限環(huán)境中，生物膜聚集體的生長受初始細菌濃度和水凝膠硬度協(xié)同調控，在更硬且具有特定應力松弛特性的水凝膠中，較低的初始接種濃度會形成更大的生物膜聚集體。這些發(fā)現(xiàn)為設計調控水凝膠-細菌相互作用的生物材料(用于組織工程、傷口愈合等生物醫(yī)學應用)提供了重要見解，并為開發(fā)基于力學調控水凝膠的先進生物膜系統(tǒng)奠定了基礎。

六、參考文獻

Scutte A, Harrison K, Gregory T, Quashie D Jr, Ramakrishnan S, Ali J. Rheological Characterization and 3D Fabrication of Artificial Bacterial Biofilms. ACS Biomater Sci Eng. 2025 Jun 9;11(6):3455-3466. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsbiomaterials.5c00223