電紡+近場直寫打印小直徑血管支架

來源：EngineeringForLife

血管移植，特別是小直徑血管(<6mm)的替換仍然是臨床醫(yī)學的一大主要挑戰(zhàn)。因為植入物會產生比如堵塞、內膜增生或血栓相關問題。為促進組織再生，血管支架還應該引導細胞分化以獲得天然血管的功能。為此，支架必須引導管腔內部內皮細胞單層的形成以模擬血管內膜。此外，還應實現血管平滑肌細胞(vSMCs)的堆積和定向來模擬膜介質的外層。到目前為止，如何設計與制造符合要求的支架來促進仍然是一個挑戰(zhàn)。為此烏得勒支大學的Debby Gawlitta和維爾茨堡大學的Jürgen Groll在Advanced Functional Materials上發(fā)表了“Heterotypic Scaffold Design Orchestrates Primary Cell Organization and Phenotypes in Cocultured Small Diameter Vascular Grafts”，文章介紹了一種由溶液電紡絲與熔融近場電直寫相結合的混合制造方法，制備了一種能模擬組織結構的雙層復合管狀支架，其中包括內層隨機定向的致密纖維網和外層定向可控的纖維。該支架能夠誘導細胞形成連續(xù)的管腔單層內皮細胞和定向的平滑肌細胞層，從而促進組織細胞特異性分化。并且該方法不需要額外的可溶性因子或支架表面的生物活化材料，說明異型支架的結構設計可以誘導細胞的生長和分化。

血管支架有5個要求：

• 支架應提供一種基底，使內皮集落形成細胞（ECFCs）在其上形成單層。
• 支架上形成的內皮細胞單層應表達成熟的EC標志物、基底膜成分和ECM，以及與vSMCs溝通相關的信號。
• 支架應該具有一個多孔的外層，vSMCs可以在其中遷移和填充，以實現多層細胞組織的伸長。
• vSMCs應以近圓周方向排列，具體由可由支架纖維的方向控制。
• 支架應該為間充質干細胞（MSCs）分化為vSMCs收縮表型提供環(huán)境
  

因此，研究人員提出一種混合工藝的復合血管支架制造工藝，如圖 1。首先由溶液電紡PCL纖維形成管狀支架內層(孔隙率為80%±5%，內徑3mm)，纖維直徑為1.4±0.2μm，纖維去向隨機分布。其次，用同樣的材料采用熔融近場電直寫的工藝制作外層，纖維直徑15.2±4.8μm，纖維纏繞角度在30°到70°之間，具有可控制的大孔徑。

圖1 雙層管狀支架的制造。A）溶液靜電紡絲制造管狀支架內層。B）熔融電直寫將定向纖維沉積在管狀支架外層。C）雙層支架最終結構。雙層支架由同種材料組成，不同尺寸的纖維融合在一起，防止分層。

支架的體外實驗結果如圖 2，成功將尚未內皮化的ECFCs與MSCs共培養(yǎng)，并且ECFCs未滲透過孔徑非常小的溶液紡絲層。掃描電鏡(SEM)顯示相鄰的ECs(黑色箭頭)與纖維(白色箭頭)之間建立了連接，表明內皮細胞受到限制，通透性較低。在體內，具有屏障功能的內皮細胞是抵抗血栓形成的關鍵。這樣就產生了具有抗凝血特性的內層，類似于天然內皮的特性。

同樣，單層膜顯示血小板黏附糖蛋白因子(vwF)內皮標記物染色陽性(圖2D)，并由iv型膠原陽性基質(圖2E)支撐，這也天然基底膜中發(fā)現，說明了支架仿生性能。一氧化氮被認為是主要的血管擴張劑之一，參與抑制血小板聚集，是功能化內皮細胞所必需的。在實驗中中測量到的NO表明，當在仿生雙層支架上培養(yǎng)時，所形成的內皮細胞具有功能并具有向類vsm細胞發(fā)出信號的能力。

此外，大孔隙和較粗的近場電直寫纖維可以誘導類vsm細胞快速滲透，從而滿足MSC/ECFC共培養(yǎng)(圖2J)和MSC單培養(yǎng)。接種的MSCs覆蓋整個支架的外表面(圖2G)，并呈直線排列(圖2H)。IV型膠原也被合成(圖2I)，它將單個的vSMCs包裹成基底膜樣基質。

圖2 雙層異質血管支架上的細胞培養(yǎng)結果。A）的同時培養(yǎng)ECFCs (CD31 +)和vSM-like細胞(αSMA +)后17 天的分層組織 (橫斷面視圖)；B）溶液紡絲層上細胞的內皮化；C）緊密的細胞連接(黑色箭頭)和細胞擠壓(白色箭頭)；D）和E）內皮細胞的特異性表達；F）內皮細胞產生一氧化氮(NO)向vSM-like細胞傳遞信號；G） vSM-like細胞的定向排列；H）沿著纖維伸長的αSMA +細胞；I）IV型膠原在細胞排列方向的沉積；J）在7天后vSM-like細胞充滿了管壁，并呈圓周方向排列。除有特殊標注外，比例尺為100μm。

對于近場電直寫的支架外層結構，隨著支架纖維纏繞角的增加，細胞的方向改變?yōu)榻�周�?圖3A)，與原膜介質相同。通過控制纖維的取向，可以模擬組織的方式引導管狀支架上的vSMCs的取向。外層的多孔結構促進了細胞的快速生長，并產生了幾層定向排列的細胞，細胞間具有密切相互作用。

圖3 熔融纖維取向對間充質干細胞的影響。A)代表性支架植入前掃描電鏡圖像(上)和植入后培養(yǎng)7 天后 F-actin染色細胞 (下)。B)整個管壁厚度上的細胞以及熔融電直寫粗纖維的平均取向。

為了更深入地調查在大孔徑支架上增加的細胞相互間作用對MSCs分化的影響。研究人員比較具備與不具備外側熔融電直寫纖維的細胞結果。結果表明在孔板中與單層溶液紡絲支架上培養(yǎng)的MSCs具有相似的相對基因表達水平。而在雙層血管結構培養(yǎng)的MSCs與單溶液紡絲層培養(yǎng)的MSCs基因表達水平具有較大區(qū)別。DNA與蛋白表達的實驗結果也是類似。

圖4 融合驅動的MSCs向vSMCs分化結果。A）培養(yǎng)7 d和14 d后在孔板中與單層溶液紡絲支架上培養(yǎng)的MSCs相似的相對基因表達水平；B）培養(yǎng)7 d和14 d后，雙層血管結構培養(yǎng)的MSCs與單SES層培養(yǎng)的MSCs基因表達水平的比較；C-D）qPCR對比結果；E-H）細胞在單純溶液紡絲支架與雙層異質支架上的蛋白表達區(qū)別。

這種復合結構的異質支架具有類似于原生血管內外膜結構，內側溶液紡絲層具有小直徑與低細胞通透性，能促進內皮細胞層的形成；而低纖維密度、可控沉積定向的多孔外膜是實現類vsm細胞定向快速定植的基礎。不需要可溶性因子和表面功能化，緊靠放生的結構設計，引導指導細胞的形態(tài)和分化。未來還可以探索是否可以利用這種異型設計來調節(jié)免疫反應，使之朝著再生的方向發(fā)展。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.201905987