3D打印肌肉／神經(jīng)細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架促進(jìn)肌缺損恢復(fù)

供稿人：邱鎮(zhèn)南、賀健康 供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

組織工程肌肉是治療肌肉缺損的一種正在被廣泛研究的方法。通過生物3D打印技術(shù)制造組織工程肌肉能夠很好的模擬天然骨骼肌的定向束結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)工作中，研究者提出將神經(jīng)細(xì)胞與肌細(xì)胞混合到同種凝膠中，并通過多材料復(fù)合3D打印技術(shù)制造骨骼肌支架的方法。研究神經(jīng)細(xì)胞的引入對(duì)肌細(xì)胞成熟、肌細(xì)胞長(zhǎng)期存活與功能化生成肌肉-神經(jīng)連接的作用。

該研究所使用的多材料多細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架3D打印設(shè)備如圖1 a所示，該設(shè)備具有3個(gè)打印噴頭，分別填裝有細(xì)胞水凝膠、生物聚合物PCL和犧牲水凝膠。多材料多細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架3D打印后結(jié)構(gòu)如圖1 b所示，載有肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的水凝膠束與犧牲凝膠束平行相間排布，在凝膠束的兩端打印PCL固定結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖1 （a）多材料多細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架3D打印設(shè)備；（b）多材料多細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架結(jié)構(gòu)示意圖；（c）去除犧牲水凝膠后復(fù)合骨骼肌示意圖具備微流道，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與肌細(xì)胞建立肌肉-神經(jīng)連接

在打印復(fù)合骨骼肌支架前，通過體外培養(yǎng)肌細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞水凝膠并進(jìn)行肌肉-神經(jīng)連接功能化表征實(shí)驗(yàn)，確定了水凝膠中肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞密度比為300：1時(shí)能達(dá)到最好的功能化效果。如圖2所示，使用該細(xì)胞比例打印了肌肉/神經(jīng)細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架。復(fù)合骨骼肌支架在細(xì)胞活性和肌功能蛋白表達(dá)方面都優(yōu)于單純肌細(xì)胞的支架。并且復(fù)合骨骼肌支架中的肌細(xì)胞生成了更多的乙酰膽堿受體結(jié)構(gòu)，同時(shí)形成了肌肉-神經(jīng)連接。

圖2 神經(jīng)元的引入對(duì)肌細(xì)胞功能化起到了促進(jìn)作用 (a)復(fù)合骨骼肌支架打印路徑 (b)復(fù)合骨骼肌支架實(shí)物圖 (c)復(fù)合骨骼肌支架凝膠束死活染色結(jié)果 (d)骨骼肌支架體外培養(yǎng)1天后的細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (e-g) 骨骼肌支架體外培養(yǎng)7天后的MHC染色、肌管長(zhǎng)度結(jié)果 (h-i)神經(jīng)細(xì)胞體外分化培養(yǎng)染色 (j-l)骨骼肌支架中MHC、肌肉乙酰膽堿受體蛋白和神經(jīng)絲染色(m)骨骼肌支架中乙酰膽堿受體比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n)骨骼肌支架中乙酰膽堿受體和神經(jīng)絲重貼區(qū)域面積占比統(tǒng)計(jì)結(jié)果

如圖3 所示，在大鼠TA肌肉缺損模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，肌肉/神經(jīng)細(xì)胞復(fù)合骨骼肌支架使得肌缺損得到了更好的恢復(fù)。減少了缺損區(qū)域纖維蛋白沉積，即緩解了缺損處形成無功能的疤痕，增加了肌肉含量。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元長(zhǎng)入情況也得到了改善。

圖3 復(fù)合骨骼肌支架植入大鼠TA肌肉缺損模型4~8周后的修復(fù)效果

總的來說，在組織工程骨骼肌支架中引入神經(jīng)細(xì)胞可以支持肌細(xì)胞的長(zhǎng)期存活，增強(qiáng)肌源性分化，并誘肌肉-神經(jīng)連接的形成。在大鼠TA肌肉缺損模型中該支架也促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元長(zhǎng)入并減少了疤痕組織的形成提高了缺損區(qū)域功能化骨骼肌的占比。所以該方法是一種能夠有效加快骨骼肌缺損功能恢復(fù)的方法。

參考文獻(xiàn)：
J. H. Kim, I. Kim, Y. J. Seol, I. K. Ko, J. J. Yoo, A. Atala, et al. (2020) Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun 2020 Vol. 11 Issue 1 Pages 1025. DOI: 10.1038/s41467-020-14930-9