中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科金榆凱博士發(fā)表 "多細(xì)胞 3D 生物打印人膽囊癌,...

膽囊癌 (GBC) 是一種惡性肝膽管癌，具有復(fù)雜腫瘤微環(huán)境 (TME) 和異質(zhì)性的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的 GBC 2D 培養(yǎng)模型無(wú)法忠實(shí)地重現(xiàn)TME的特征。近日，榆凱博士開(kāi)發(fā)了一種多細(xì)胞 3D 生物打印人膽囊癌，用于腫瘤微環(huán)境和瘤內(nèi)異質(zhì)性的體外模擬。該文章名為“Multicellular 3D bioprinted human gallbladder carcinoma for in vitro mimicry of tumor microenvironment and intratumoral heterogeneity”，發(fā)表在Biofabrication 上。本研究基于三維 (3D) 生物打印技術(shù)可以建立高通量和高保真度的多細(xì)胞GBC模型，設(shè)計(jì)了一個(gè)同心圓柱四培養(yǎng)模型來(lái)重建腫瘤組織中細(xì)胞的空間分布，其中內(nèi)部包含GBC細(xì)胞，外環(huán)包含內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的混合物。GBC 3D四培養(yǎng)模型的存活、增殖、生物標(biāo)志物表達(dá)和基因表達(dá)譜。蘇木精-伊紅(HE)和免疫熒光染色驗(yàn)證了GBC 3D四培養(yǎng)模型中GBC/內(nèi)皮細(xì)胞/成纖維細(xì)胞/巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物的形態(tài)和穩(wěn)健表達(dá)。單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示，模型中GBC細(xì)胞有兩種不同的亞型：腺上皮細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞，提示腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的模擬。對(duì)各種體外模型的轉(zhuǎn)錄組譜比較分析表明，3D四培養(yǎng)模型中的細(xì)胞相互作用和TME將腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程重塑為更具侵襲性的表型。GBC 3D四培養(yǎng)模型恢復(fù)了TME的特征以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，該模型有望在腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)中得到應(yīng)用。

一、背景介紹

膽囊癌 (GBC) 是第五大最常見(jiàn)的消化道腫瘤，總發(fā)病率為每100000人3例。它是膽道惡性腫瘤中最常見(jiàn)的癌癥，在所有膽囊切除術(shù)中占0.2% – 3%，在腹腔鏡膽囊切除術(shù)中占 0.09% – 2%。值得注意的是，只有30%的患者在術(shù)前懷疑患有GBC，其余70%的患者是通過(guò)術(shù)后病理偶然診斷出來(lái)的。GBC具有較高的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率，且尚無(wú)公認(rèn)的最佳輔助治療方法；此外，研究腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和藥物開(kāi)發(fā)的機(jī)制的方法也十分缺乏。值得注意的是，Nepalet al采用了全面的基因組方法來(lái)表征GBC并研究與患者生存相關(guān)的分子亞型。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了腫瘤微環(huán)境(TME)和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性在GBC發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。盡管有一項(xiàng)研究旨在通過(guò)構(gòu)建患者來(lái)源的GBC類(lèi)器官來(lái)探究GBC致癌過(guò)程，但成功率不到15%。因此，迫切需要一種能夠模擬TME并重建細(xì)胞多樣性、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分和空間組織的體外模型。

三維生物打印技術(shù)是一種新興的生物工程技術(shù)，將細(xì)胞與生物材料混合，精確打印具有復(fù)雜空間排列的人造器官和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。該技術(shù)能夠在體外構(gòu)建具有復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞三維組織，有助于模擬腫瘤異質(zhì)性和微環(huán)境。近年來(lái)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?？茖W(xué)家已經(jīng)利用3D生物打印制造模擬特定結(jié)構(gòu)和功能的體外組織，以進(jìn)行機(jī)制探索和藥物開(kāi)發(fā)。

在本研究中的主要目標(biāo)是利用3D生物打印技術(shù)制造具有細(xì)胞相互作用和TME的多細(xì)胞GBC模型，旨在重現(xiàn)GBC的細(xì)胞多樣性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。評(píng)估了生物打印組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的存活率、增殖和腫瘤相關(guān)特征。對(duì)2D培養(yǎng)、3D單培養(yǎng)和3D四培養(yǎng)GBC模型進(jìn)行了基因表達(dá)譜比較。預(yù)計(jì)該模型將在未來(lái)的腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

二、材料與方法
2.1 概念設(shè)計(jì)
腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都發(fā)生在一定的內(nèi)環(huán)境中，即TME。TME是一個(gè)由多種成分組成的復(fù)雜系統(tǒng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和ECM。TME在腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展和耐藥性中起著重要作用。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)增殖信號(hào)、消除生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、參與免疫逃逸和抵抗細(xì)胞死亡。許多研究表明，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌血管生成因子來(lái)募集內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤塊內(nèi)形成新生血管網(wǎng)絡(luò)。這些血管具有很強(qiáng)的通透性，因?yàn)槟[瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞具有較少的緊密連接，并且與基底膜的附著較少。
本研究旨在通過(guò)3D生物打印技術(shù)建立體外多細(xì)胞組分四培養(yǎng)模型，恢復(fù)組織中不同細(xì)胞的空間分布，準(zhǔn)確模擬腫瘤微環(huán)境。理想的3D腫瘤模型包括腫瘤細(xì)胞構(gòu)成核心結(jié)構(gòu)，周?chē)陌び沙衫w維細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)中的內(nèi)皮細(xì)胞形成微血管供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)和氧氣，免疫細(xì)胞散布在血管周?chē)８鶕?jù)這些原理，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)同心圓柱形體外多細(xì)胞組分四培養(yǎng)模型(圖1(A))。圓柱體內(nèi)側(cè)包含膽囊癌細(xì)胞GBC-SD，外側(cè)環(huán)包含內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的混合物，以模擬包膜組織。我們?cè)O(shè)計(jì)的單絲直徑為0.3 mm，內(nèi)側(cè)和外側(cè)環(huán)的線(xiàn)距分別為0.4 mm和0.3 mm。內(nèi)筒有8個(gè)環(huán)，外筒有4個(gè)環(huán)，共堆疊4層，最終高度為1.2mm。

圖 1. 使用基于擠壓的3D 生物打印技術(shù)制造和表征GBC 3D四培養(yǎng)模型。 (A) 3D四培養(yǎng)模型示意圖，其中 GBC-SD 位于內(nèi)筒中，其他三種基質(zhì)細(xì)胞位于外部空心筒中； (B) 3D四培養(yǎng)模型的生物打印腫瘤組織的代表性照片。比例尺代表5毫米；(C)細(xì)胞在3D四培養(yǎng)模型的生物打印腫瘤組織中形成球形結(jié)構(gòu)。這些圖中表示了比例尺；(D) 7天的3D四培養(yǎng)模型的HE染色。細(xì)胞形成球形結(jié)構(gòu)；(E)組織軟化和固定后生物打印組織中不同尺度的照片。

2.1 3D生物打印組織的構(gòu)建

使用兼容雙噴嘴打印的 3D 生物打印機(jī) (ALPHA-CPT1, SUNP BIOTECH) 來(lái)制造這些腫瘤組織。將預(yù)熱的12% (w/v) 明膠和4% (w/v) 海藻酸鈉溶液與細(xì)胞懸浮液以2:1:2的比例混合，以達(dá)到4.8% (w/v) 明膠和0.8% (w/v)海藻酸鈉的最終濃度。3D單培養(yǎng)模型的中心為 1.25×107ml−1 GBC-SD細(xì)胞，周?chē)菦](méi)有細(xì)胞成分的生物材料。3D四培養(yǎng)模型具有相同的中心GBC-SD，其周?chē)?:1:1的HUVEC、分化的THP-1和CCC-ESF-1混合物，總濃度為0.75×107ml−1 GBC-SD細(xì)胞。這些組織是通過(guò)逐層強(qiáng)制擠壓制成的。將生物打印組織收集在35 mm培養(yǎng)皿中，立即用100 mM CaCl2處理3分鐘以交聯(lián)海藻酸鈉。然后在3 ml的H-DMEM(補(bǔ)充有 10% FBS、1% 青霉素G和鏈霉素、40 ng ml−1堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和40 ng ml−1血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)中培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。

三、結(jié)果

3.1 3D生物打印組織的構(gòu)建

GBC由多種不同的惡性腫瘤細(xì)胞和支持基質(zhì)細(xì)胞組成?；颊咧g和腫瘤組織內(nèi)部存在顯著的異質(zhì)性。此外，不同細(xì)胞類(lèi)型之間復(fù)雜的細(xì)胞相互作用及其與ECM的相互作用在 GBC的表型多樣性、增殖和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。為了超越傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)皿體外模型利用基于擠壓的3D生物打印平臺(tái)構(gòu)建了3D四培養(yǎng)模型，其中的生物材料模擬了腫瘤ECM。這些模型由GBC細(xì)胞的腫瘤核心和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的基質(zhì)囊組成。

如前所述，這些細(xì)胞類(lèi)型被組裝成同心圓柱體，產(chǎn)生體外3D四細(xì)胞培養(yǎng)模型，其核心由GBC-SD細(xì)胞組成，外環(huán)有或沒(méi)有基質(zhì)細(xì)胞，包括HUVEC、CCC-ESF-1和分化的THP-1。逐層制造后，3D生物打印組織與100 mM CaCl2交聯(lián)3分鐘，以增強(qiáng)模型的穩(wěn)定性。在宏觀(guān)尺度上，模型的高度為1.2毫米，內(nèi)半徑和外半徑分別為3.15毫米和4.20毫米。3D生物打印組織的ECM由明膠和海藻酸鈉水凝膠組成，細(xì)胞嵌入其中(圖1(A))。明膠是一種由膠原蛋白部分水解而來(lái)的蛋白質(zhì)，與體內(nèi)的膠原蛋白同源，是一種生物相容性材料，可以模擬GBC組織中ECM的組成。海藻酸鈉是一種多糖，當(dāng)暴露于氯化鈣(CaCl2)時(shí)，會(huì)通過(guò)形成海藻酸鈣而交聯(lián)。其生物相容性已得到廣泛研究和證實(shí)。在優(yōu)化了為評(píng)估模型的逼真度和體外細(xì)胞存活率，選擇腫瘤核心內(nèi)GBC細(xì)胞的濃度為1.25×107 ml−1，外部基質(zhì)組織中細(xì)胞的濃度為0.75×107 ml−1。外環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例為1:1:1(圖1(A))。

3.2 GBC 3D 四培養(yǎng)模型的特征

GBC 3D四培養(yǎng)模型形狀良好，內(nèi)部邊界清晰，這是由于模型內(nèi)細(xì)胞濃度不同所致(圖1(B))。將生物打印的組織培養(yǎng)在添加bFGF和VEGF的H-DMEM中，在CaCl2處理3分鐘后，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，以保持體外模型的結(jié)構(gòu)完整性。生物3D打印組織內(nèi)細(xì)胞呈球形結(jié)構(gòu)，體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞半徑不斷增大(圖1(C))。蘇木精和伊紅(HE)染色顯示了這些組織的結(jié)構(gòu)，顯示出不同的細(xì)胞形態(tài)和組織樣細(xì)胞密度(圖1(D))。細(xì)胞能夠緊密聚集，形成緊密相互作用的球形結(jié)構(gòu)(圖1(E))。

采用Calcein-AM/PI染色來(lái)評(píng)估這些3D生物打印組織的細(xì)胞存活率，通過(guò)熒光定量確定準(zhǔn)確的存活率(圖2(A))。對(duì)于3D四培養(yǎng)模型和3D單培養(yǎng)模型，在最初7天內(nèi)存活率保持穩(wěn)定。體外培養(yǎng)第7天，3D四培養(yǎng)模型的存活率顯著高于3D單培養(yǎng)模型。在體外培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)生物3D打印組織中的總細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖2(B))。在培養(yǎng)的前3天，3D四培養(yǎng)模型的細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定，且明顯大于3D單培養(yǎng)模型。然而，3D四培養(yǎng)模型的細(xì)胞計(jì)數(shù)在7天減少(3.518×105  vs. 5.366×105, p = 0.03)。相比之下，3D單培養(yǎng)模型的細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定，并在體外培養(yǎng)過(guò)程中逐漸增加。這種差異可能歸因于體外培養(yǎng)過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響以及GBC細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。

圖2. GBC在3D模型0、3、7、10天時(shí)的存活和增殖特征。(A)不同組生物打印組織細(xì)胞的活率。通過(guò)Calcein-AM/PI染色定量計(jì)算活率；(B)不同組生物打印組織細(xì)胞總數(shù)；(C)通過(guò)CCK8分析測(cè)量不同組生物打印組織的細(xì)胞活力。 并將第0天的平均活力設(shè)定為100%。這些圖顯示了各組之間的顯著差異。∗p < 0.05,∗∗p < 0.01；(D)顯微鏡下三維四培養(yǎng)模型在3,7和10天的細(xì)胞活率。綠色表示活細(xì)胞，紅色表示死細(xì)胞。

由于存在多種細(xì)胞類(lèi)型，僅測(cè)量活細(xì)胞率不能完全描述人工腫瘤組織的生長(zhǎng)。采用CCK-8測(cè)定法評(píng)估組織活力(圖2(C))。隨著時(shí)間的推移，所有3D生物打印組織的活力都略有下降，僅在第3天觀(guān)察到顯著差異。培養(yǎng)7天后，各組織的總活力無(wú)顯著差異。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，隨著時(shí)間的推移，活菌率也略有下降(圖2(D))。綜上所述，與3D模型相比，3D四培養(yǎng)模型的存活率和細(xì)胞活力顯著提高隨著時(shí)間的推移保持穩(wěn)定，而總細(xì)胞計(jì)數(shù)在7天后發(fā)生變化。因此，選擇生物打印后第7天作為后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)。

3.3 多種細(xì)胞類(lèi)型在GBC 3D四培養(yǎng)模型中存活

為了評(píng)估 GBC-SD特異性生物標(biāo)志物的表達(dá)，在第7天對(duì)GBC 3D四培養(yǎng)模型進(jìn)行了免疫熒光。一般情況下，3D四培養(yǎng)模型中的GBC-SD細(xì)胞對(duì)CK7表達(dá)呈陽(yáng)性。此外，GBC-SD 細(xì)胞主要保留在內(nèi)筒中，尤其是在邊界處，有幾個(gè)膽囊癌細(xì)胞遷移到外筒中(圖3(A))。模型中有Ki-67和CK7雙陽(yáng)性細(xì)胞，表明體外培養(yǎng)過(guò)程中 GBC-SD 細(xì)胞的增殖(圖3(B))。水凝膠解聚后，腫瘤細(xì)胞在球體結(jié)構(gòu)中顯示出密切的相互作用(圖3(C))。

圖 3. 第7天GBC 3D四培養(yǎng)模型中GBC-SD 的免疫熒光。(A) 3D 生物打印組織的總體遠(yuǎn)景;(B) 3D生物打印組織的微觀(guān)視覺(jué);(C)水凝膠解聚后球體結(jié)構(gòu)的照片。對(duì)CK7(綠色)和Ki67(紅色)進(jìn)行熒光染色。DAPI (藍(lán)色)是一種細(xì)胞核復(fù)染劑。

HUVEC作為3D四培養(yǎng)模型中基質(zhì)細(xì)胞的一部分被生物打印到生物打印組織的外筒中。進(jìn)行CD31免疫熒光染色以評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物[圖4(A)]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在腫瘤的存活、增殖和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，顯著影響腫瘤組織的生物學(xué)特性。在3D 四培養(yǎng)模型中使用了CCC-ESF-1細(xì)胞，并使用α-SMA染色跟蹤這些成纖維細(xì)胞。生物打印組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞位于外圓柱體中(圖4(B))。為了模擬3D生物打印組織中的復(fù)雜 TME，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是免疫細(xì)胞的簡(jiǎn)單表示。THP-1細(xì)胞廣泛用于體外實(shí)驗(yàn)。這些細(xì)胞在生物打印前一天被誘導(dǎo)為M0巨噬細(xì)胞。CD68染色顯示，巨噬細(xì)胞主要保留在這些組織的外筒中，少數(shù)被極化成CD163表達(dá)陽(yáng)性的M2巨噬細(xì)胞(圖4(D))。

圖 4.  第7天 GBC 3D四培養(yǎng)模型中HUVEC、CCC-ESF-1和THP-1的免疫熒光。(A) CD31 (綠色) 染色用于評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物。α-SMA (紅色) 染色以區(qū)分成纖維細(xì)胞。DAPI (藍(lán)色) 是一種細(xì)胞核復(fù)染劑。(B) 對(duì)α-SMA 進(jìn)行熒光染色(紅色)。DAPI (藍(lán)色) 是一種細(xì)胞核復(fù)染劑。(C) 對(duì)CD68(綠色)和CD163(紅色)進(jìn)行熒光染色。DAPI (藍(lán)色) 是一種細(xì)胞核復(fù)染劑。

3.4 單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示了3D四培養(yǎng)模型中的瘤內(nèi)異質(zhì)性

為了探索腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和TME中不同基質(zhì)細(xì)胞的存在，在第7天對(duì)GBC 3D四培養(yǎng)模型進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)清理，從8983個(gè)單細(xì)胞獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。基于經(jīng)典生物標(biāo)志物的表達(dá)和t分布隨機(jī)鄰域嵌入(t-SNE)分析，成功鑒定了四種不同的細(xì)胞類(lèi)型：上皮細(xì)胞(GBC-SD)、內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、巨噬細(xì)胞(THP-1)和成纖維細(xì)胞(CCC-ESF-1) (圖 5(A))。四種不同的細(xì)胞類(lèi)型表現(xiàn)出不同的群體，包括187個(gè)巨噬細(xì)胞、7076個(gè)GBC細(xì)胞、689個(gè)成纖維細(xì)胞和1031個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞 (圖 5(B))。每種細(xì)胞類(lèi)型的典型生物標(biāo)志物表達(dá)水平如圖 5(C) 所示。此外，GBC 3D四培養(yǎng)模型中的基質(zhì)細(xì)胞分別概括了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞、TAM和腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的譜系特異性標(biāo)志物。這些結(jié)果表明，體外培養(yǎng)后 GBC-SD 細(xì)胞是3D四培養(yǎng)模型的主要成分，但TME仍然包含不同數(shù)量的三種腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型。

圖 5. 通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定的3D四培養(yǎng)模型中的不同細(xì)胞類(lèi)型和瘤內(nèi)異質(zhì)性。(A) t-SNE 圖在 3D 四培養(yǎng)模型中鑒定了4種細(xì)胞類(lèi)型;(B)顯示了3D四培養(yǎng)模型中分配的4種細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)量;(C)小提琴圖顯示了4種不同細(xì)胞類(lèi)型中經(jīng)典生物標(biāo)志物的表達(dá)水平;(D) GBC-SD 細(xì)胞的 t-SNE 圖鑒定了2種主要細(xì)胞亞型，包括鱗狀上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞;(E) 腺上皮生物標(biāo)志物(CDH1 和 TFF1) 的t-SNE 圖，由基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度著色;(F) 鱗狀上皮生物標(biāo)志物(KRT19、CD24、KRT5和KRT15) 的t-SNE 圖，由基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度著色;(G) 小提琴圖顯示了(D)中鑒定的2個(gè)不同細(xì)胞簇中經(jīng)典生物標(biāo)志物的表達(dá)水平;(H) GSVA 圖顯示了鱗狀上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志性基因集富集結(jié)果的不同術(shù)語(yǔ)。顯示了使用robust rank aggregation(左圖)以及 AUCell、UCell、singscore 和 ssgsea(右圖)的富集分析結(jié)果。

起源于膽囊粘膜上皮細(xì)胞的GBC大致可分為兩種亞型：膽囊腺癌和腺鱗狀細(xì)胞癌。通過(guò)分析經(jīng)典上皮生物標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步將3D四培養(yǎng)模型中的GBC-SD細(xì)胞分為兩個(gè)基因表達(dá)譜顯著不同的細(xì)胞簇(圖 5(D))。在EPCAM+/CDH1+上皮細(xì)胞中，角蛋白(包括 KRT19、KRT5 和 KRT15)表達(dá)較高的一組被注釋為鱗狀上皮細(xì)胞，而另一組分泌蛋白表達(dá)較高，以三葉因子(TFF1) 表達(dá)為特征，被指定為腺上皮細(xì)胞(圖5(E)-(G)).鱗狀上皮細(xì)胞主要存在于 GBC 的腺鱗狀細(xì)胞癌亞型中，而腺上皮細(xì)胞主要存在于膽囊腺癌中。然而，這兩個(gè)上皮細(xì)胞簇的分布也表現(xiàn)出顯著的患者間和瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，3D四培養(yǎng)模型有效地概括了瘤內(nèi)異質(zhì)性，這可能是由模型內(nèi)GBC-SD細(xì)胞的不同空間分布以及與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用決定的。

為了進(jìn)一步研究生物打印組織的瘤內(nèi)異質(zhì)性，對(duì)GBC細(xì)胞的兩個(gè)細(xì)胞簇進(jìn)行了 irGSEA。采用了基于單樣本基因表達(dá)譜的基因集富集分析方法，包括AUCell、UCell、singscore和ssGSEA。通過(guò)不同結(jié)果的RRA，在兩個(gè)上皮細(xì)胞簇中鑒定了顯著豐富的標(biāo)志。在鱗狀上皮細(xì)胞簇中，血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺猬信號(hào)傳導(dǎo)、缺氧、TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)和通過(guò)NF-κB的TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)等10個(gè)標(biāo)志物被富集和上調(diào)。在腺上皮細(xì)胞簇中，氧化磷酸化的標(biāo)志物富集并上調(diào) (圖5(H))。在腺上皮細(xì)胞簇中，AUCell 基因集富集分析鑒定了33個(gè)下調(diào)的基因集和12個(gè)上調(diào)的基因集;UCell 基因集富集分析確定了39個(gè)下調(diào)的基因集和9個(gè)上調(diào)的基因集;SingScore 基因集富集分析確定了50個(gè)下調(diào)的基因集;ssGSEA鑒定了39個(gè)下調(diào)的基因集和8個(gè)上調(diào)的基因集(圖5(H))。

3.5 基因表達(dá)譜隨細(xì)胞組成和組織結(jié)構(gòu)而變化

為了評(píng)估和比較這些生物打印組織中的 TME，在第7天對(duì)2D培養(yǎng)的GBC細(xì)胞、3D培養(yǎng)的GBC細(xì)胞和3D四培養(yǎng)的GBC細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。對(duì)于3D四培養(yǎng)模型，最初在顯微鏡下從中央核心區(qū)域分離出由GBC-SD細(xì)胞組成的腫瘤組織。降解3D生物打印組織后，從多個(gè)模型中分離出總RNA，用于后續(xù)測(cè)序。評(píng)估了這些樣本的RNA測(cè)序質(zhì)量，超過(guò)90%的基因錯(cuò)誤率低于0.01%。通過(guò)DESeq2鑒定校正P值< 0.05和log2 (倍數(shù)變化[FC])⩾2.5的基因。在基于這些基因生成火山圖之后，滿(mǎn)足−log10 (Padj)⩾17和|log2(倍數(shù)變化[FC])|⩾2.5被認(rèn)為是DEG。對(duì)每組的生物重復(fù)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)主成分分析 (PCA)，同一組的樣品表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性。PCA和DEGs的熱圖都揭示了3D四培養(yǎng)模型、3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間不同的基因表達(dá)譜(圖6(A)和(B))。

圖 6. 3D四培養(yǎng)模型中的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜。(A)來(lái)自不同模型樣本的主成分分析。y 軸表示主成分 2，其方差比例為30.51%。下面的 x 軸表示主成分1，其方差比例為45.96%。樣本在二維平面上表示為點(diǎn)，它們之間的距離顯示了差異;(B) 顯示3D四培養(yǎng)模型、3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型中DEGs 基因表達(dá)水平的熱圖;(C) 3D 四培養(yǎng)模型與 3D 單一培養(yǎng)模型的火山圖上的 DEG 比較。y 軸表示顯著性，即 log10(padjusted)。x 軸表示對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的折疊變化 (FC)，即log2FC。顯著上調(diào)的DEG以紅色顯示。下調(diào)的DEG以藍(lán)色顯示，而沒(méi)有顯著變化的基因以黑色顯示;(D)與3D單一培養(yǎng)模型的基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs的功能注釋。左側(cè)的y軸表示不同的GO術(shù)語(yǔ)。下面的x軸表示單個(gè)通路中的DEG數(shù)量。不同的 GO術(shù)語(yǔ)按GO注釋的類(lèi)別著色。圖 中說(shuō)明了p調(diào)整后< 0.05的為顯著富集的GO通路;(E) 3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間細(xì)胞對(duì)趨化因子通路反應(yīng)的基因集富集分析(GSEA)。q= 0.03;(F)參與3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間免疫反應(yīng)通路的細(xì)胞活化的GSEA。q= 0.03;(G) 3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間細(xì)胞遷移途徑的正調(diào)控的GSEA。q= 0.04。DEGs代表差異表達(dá)基因。

3.5.1 3D 生物打印組織中的腫瘤細(xì)胞顯示出不同的基因表達(dá)譜
與3D單一培養(yǎng)模型相比，在3D四培養(yǎng)模型中共鑒定出582個(gè)DEG，包括514個(gè)上調(diào)基因和68個(gè)下調(diào)基因(圖6(C))。使用基因本體論(GO) 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些DEGs進(jìn)行注釋?zhuān)栽u(píng)估它們的功能。GO注釋顯示，富集的GO項(xiàng)主要集中在生物過(guò)程類(lèi)別中(圖6(D))。值得注意的是，3D四培養(yǎng)模型的特征是細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)、參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞活化和細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)(圖6(E)–(G))。GO富集分析結(jié)果表明，3D四培養(yǎng)模型中的3種不同基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型對(duì)GBC細(xì)胞有顯著影響，突出了腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞相互作用對(duì)腫瘤組織生物學(xué)特性的影響。此外，將3D四培養(yǎng)模型與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)模型進(jìn)行了比較，3D四培養(yǎng)模型中GBC細(xì)胞的基因表達(dá)譜表現(xiàn)出顯著改變。有464個(gè)上調(diào)的DEG和113個(gè)下調(diào)的DEG [圖7(A)]。與上述結(jié)果一致，大多數(shù)富集的GO術(shù)語(yǔ)被歸類(lèi)為生物過(guò)程(圖7(B))。具體來(lái)說(shuō)，3D四培養(yǎng)模型在與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞粘附和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)的過(guò)程中表現(xiàn)出顯著富集(圖 7(C)–(E))。此外，對(duì)TME相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了GSVA，例如免疫反應(yīng)、ECM組織和對(duì)缺氧的反應(yīng)，所有這些術(shù)語(yǔ)在3D四培養(yǎng)模型中的富集評(píng)分都顯著高于3D單培養(yǎng)和 2D培養(yǎng)?？傊?D四培養(yǎng)模型表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜，表明與三種基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)比3D單一培養(yǎng)和2D培養(yǎng)更好的TME復(fù)制。

圖 7.分析3D四培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物以及3D單培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物的DEG。(A) 3D四培養(yǎng)模型與2D 培養(yǎng)模型的火山圖上的DEG s;(B) 3D 四培養(yǎng)模型的GO數(shù)據(jù)庫(kù)與2D培養(yǎng)模型的DEGs功能注釋的比較;(C) 3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織通路的基因集富集分析(GSEA)。q = 0.005;(D) 3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細(xì)胞-細(xì)胞粘附途徑的 GSEA。q = 0.005;(E) 3D四培養(yǎng)模型和 2D 培養(yǎng)模型之間細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路的 GSEA。q = 0.01;(F) 3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的火山圖上的DEG比較;(G) 3D單一培養(yǎng)模型的GO 數(shù)據(jù)庫(kù)與2D 培養(yǎng)模型的DEGs功能注釋;(H) 3D單一培養(yǎng)模型和2D 培養(yǎng)模型之間細(xì)胞-細(xì)胞粘附途徑的 GSEA。q= 0.007;(I) 3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間細(xì)胞外基質(zhì)組織通路的GSEA。q = 0.01;(J) 3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織通路的GSEA。q= 0.02。DEGs代表差異表達(dá)基因。

進(jìn)一步比較了3D單一培養(yǎng)模型和傳統(tǒng)2D培養(yǎng)系統(tǒng)之間的轉(zhuǎn)錄差異。在該分析中，當(dāng)將3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)540個(gè)上調(diào)的DEGs和1527個(gè)下調(diào)的 DEGs(圖 7(F))。超過(guò)一半的富集GO術(shù)語(yǔ)位于生物過(guò)程類(lèi)別中(圖 7(G))。3D單一培養(yǎng)模型的轉(zhuǎn)錄譜顯示細(xì)胞間粘附、ECM 組織和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織等過(guò)程的富集(圖 7(H)–(J))。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，3D生物打印顯著增強(qiáng)了細(xì)胞-ECM相互作用，部分概括了體內(nèi)的TME。

3.5.2. 3D生物打印模型模擬復(fù)雜的細(xì)胞相互作用
腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用以及細(xì)胞-ECM相互作用共同塑造了腫瘤組織的生物行為，每個(gè)成分都會(huì)影響其他成分。為了了解這些復(fù)雜的相互作用，研究了3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的DEG，以及3D四培養(yǎng)模型和3D單一培養(yǎng)模型之間的DEG，重點(diǎn)關(guān)注交叉的DEG(圖 8(A))。該分析提供了與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)腫瘤組織生物學(xué)特性影響的更全面視圖。在選定的122個(gè)基因集中，GO富集分析顯示，大多數(shù)富集的GO術(shù)語(yǔ)集中在生物過(guò)程類(lèi)別中，包括與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、上皮細(xì)胞遷移和鈣離子隔離調(diào)節(jié)相關(guān)的過(guò)程(圖 8(B))。這些結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用與腫瘤遷移和侵襲有關(guān)，并且這些相互作用可以在3D四培養(yǎng)模型中概括。此外，比較了3D單一培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的DEG，以及3D四培養(yǎng)模型和2D培養(yǎng)模型之間的 DEGs(圖 8(C))。兩組DEG中的286個(gè)常見(jiàn)基因揭示了3D生物打印組織中ECM的存在所誘導(dǎo)的改變。3D 生物打印組織中的GBC細(xì)胞表現(xiàn)出與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)的富集[圖 8(D)]。上述結(jié)果表明，3D四培養(yǎng)系統(tǒng)中基質(zhì)細(xì)胞和ECM成分的存在顯著影響GBC細(xì)胞中的各種生物過(guò)程和細(xì)胞成分。因此，對(duì)于與腫瘤生物學(xué)相關(guān)的研究，例如機(jī)制探索和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)，選擇包含各種基質(zhì)細(xì)胞和ECM成分的模型至關(guān)重要。

圖 8. 3D 生物打印組織模擬復(fù)雜的細(xì)胞相互作用，并顯示與不良預(yù)后相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征。(A) 3D四培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEG以及3D四培養(yǎng)模型與3D單一培養(yǎng)模型的DEG之間的維恩分析。圖中說(shuō)明了基因的數(shù)量;(B)GO數(shù)據(jù)庫(kù)在A中識(shí)別的常見(jiàn)DEG的功能注釋;(C) 3D單一培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEGs 以及3D四培養(yǎng)模型與2D培養(yǎng)模型的DEG之間的維恩分析。圖中說(shuō)明了基因的數(shù)量;(D) GO數(shù)據(jù)庫(kù)在C中識(shí)別的常見(jiàn)DEG的函數(shù)注釋;(E)基于3D四培養(yǎng)模型(與3D單培養(yǎng)模型相比)的基因表達(dá)特征，對(duì)GDC泛癌 (PANCAN) 隊(duì)列患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。根據(jù)特征表達(dá)評(píng)分，將患者分為“高3D四培養(yǎng)特征”組 (n = 1495) 或“低3D四培養(yǎng)特征” 組 (n = 10011)。采用對(duì)數(shù)秩分析進(jìn)行分析，P < 0.0001;(F) 基于 3D 四培養(yǎng)模型(與 2D 培養(yǎng)模型相比)的基因表達(dá)特征對(duì) PANCAN 隊(duì)列患者進(jìn)行 Kaplan-Meier 生存分析。根據(jù)特征表達(dá)評(píng)分，將患者分為“高 3D 四培養(yǎng)特征”組 (n = 1391) 或“低 3D 四培養(yǎng)特征”組 (n = 10115)。P < 0.0001;(G) 基于 3D 培養(yǎng)模型(與 2D 培養(yǎng)模型相比)的基因表達(dá)特征對(duì) PANCAN 隊(duì)列患者進(jìn)行 Kaplan-Meier 生存分析。根據(jù)特征表達(dá)評(píng)分將患者分為“高 3D 培養(yǎng)特征”組 (n = 5184) 或“低 3D 培養(yǎng)特征”組 (n = 6322)。P < 0.0001。

此外，還使用CCC-ESF-1、分化的THP-1和HUVEC對(duì)同質(zhì)3D生物打印組織進(jìn)行了RNA測(cè)序。差異分析顯示，與傳統(tǒng)2D系統(tǒng)相比，3D生物打印組織中的基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出顯著改變的基因表達(dá)譜。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)于HUVEC，當(dāng)將3D生物打印組織與2D培養(yǎng)模型進(jìn)行比較時(shí)，有19個(gè)上調(diào)的DEGs和32個(gè)下調(diào)的DEGs。對(duì)于分化的THP-1，當(dāng)將3D生物打印組織與2D培養(yǎng)模型進(jìn)行比較時(shí)，有122個(gè)DEGs上調(diào)，66個(gè)DEGs下調(diào)。對(duì)于CCC-ESF-1，當(dāng)將3D生物打印組織與2D 培養(yǎng)模型進(jìn)行比較時(shí)，有249個(gè)DEGs上調(diào)，424個(gè)DEGs下調(diào)。

3.5.3. 3D 生物打印組織中的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與不良預(yù)后相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征

為了驗(yàn)證 GBC 3D 四培養(yǎng)模型的臨床相關(guān)性，利用來(lái)自UCSC Xena的GDC PANCAN 隊(duì)列進(jìn)行生存分析。最初，使用GSVA評(píng)估了PANCAN隊(duì)列中每個(gè)樣本的特征評(píng)分。然后，我們將簽名評(píng)分高的患者與簽名評(píng)分低的患者的預(yù)后進(jìn)行了比較。與對(duì)照組相比，目標(biāo)模型(3D 四培養(yǎng)模型或3D單一培養(yǎng)模型)中前50個(gè)上調(diào)的基因被指定為GSVA中感興趣的基因集。表現(xiàn)出較高 GSVA 評(píng)分的患者被歸類(lèi)為具有“高簽名評(píng)分”。與3D單一培養(yǎng)模型相比，對(duì)于3D四培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D 四培養(yǎng)特征評(píng)分高的患者預(yù)后明顯更差(p< 0.0001) (圖 8(E))。同樣，與2D培養(yǎng)模型相比，對(duì)于3D四培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D四培養(yǎng)特征評(píng)分高的患者預(yù)后明顯較差(p< 0.0001) (圖 8(F))。此外，比較了3D單一培養(yǎng)特征對(duì)患者預(yù)后的影響。與2D培養(yǎng)模型相比，對(duì)于3D單一培養(yǎng)模型中上調(diào)的基因特征，3D培養(yǎng)特征評(píng)分高的患者預(yù)后明顯較差 (p < 0.0001)(圖 8(G))。

此外，還利用了來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù) Genomics of Drug Sensitivity in Cancer的數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物敏感性模擬。集成電路50比較了3D Tetra培養(yǎng)物與3D單一培養(yǎng)物、3D Tetra 培養(yǎng)物與2D 培養(yǎng)物以及3D單一培養(yǎng)物與2D培養(yǎng)物特征高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞系之間的GBC藥物值。在所有3項(xiàng)比較中，特征的高表達(dá)與顯著較高的IC相關(guān)50值 (p < 0.001)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，以及GBC 3D 四培養(yǎng)模型中的細(xì)胞-ECM相互作用，可能會(huì)影響與腫瘤侵襲、治療耐藥相關(guān)的生物過(guò)程和特征，并最終導(dǎo)致較差的預(yù)后。因此，GBC 3D四培養(yǎng)模型可以作為GBC相關(guān)研究的更現(xiàn)實(shí)和臨床相關(guān)的平臺(tái)。

四、討論

本研究首次成功構(gòu)建3D生物打印的人類(lèi)多細(xì)胞膽管癌組織，該組織在體外模擬TME方面具有巨大的潛力。在設(shè)計(jì)這種復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)時(shí)，充分考慮了人膽管癌中的腫瘤-基質(zhì)比。腫瘤-基質(zhì)比是指腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的比例，其截?cái)嘀涤蒑esker等提出為50%。李等根據(jù)腫瘤-基質(zhì)比將51例膽囊癌患者分為兩組?；|(zhì)比例低于50%的患者定義為基質(zhì)貧乏組?；|(zhì)比例大于50%的患者定義為基質(zhì)豐富組。作者發(fā)現(xiàn)，腫瘤基質(zhì)豐富的膽管癌患者總體預(yù)后不良。根據(jù)這些研究的結(jié)果，初步將3D四培養(yǎng)模型中的基質(zhì)細(xì)胞比例設(shè)定為約30%。

在確定模型中的間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞是TME中的關(guān)鍵細(xì)胞成分。腫瘤環(huán)境中最突出的免疫細(xì)胞類(lèi)型是巨噬細(xì)胞。TAM是腫瘤基質(zhì)中數(shù)量最多的細(xì)胞群，約占細(xì)胞總數(shù)的30%–50%。成纖維細(xì)胞是腫瘤組織中的主要基質(zhì)細(xì)胞。在某些腫瘤類(lèi)型中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可能存在于約50%的腫瘤基質(zhì)中。因此，選擇內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞作為腫瘤模型的主要基質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型及其分布情況，分別生物打印了3D四培養(yǎng)模型和3D單聯(lián)培養(yǎng)模型，對(duì)比了不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)只有3D單聯(lián)培養(yǎng)模型的細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加，而另一組細(xì)胞數(shù)量則在一段時(shí)間內(nèi)適度下降后又恢復(fù)到初始水平。造成這種現(xiàn)象的原因可能是在計(jì)算細(xì)胞數(shù)量時(shí)無(wú)法區(qū)分每種細(xì)胞的具體類(lèi)型。在四培養(yǎng)條件下，內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞沒(méi)有以特定的比例存活，降低了細(xì)胞總數(shù)。在后期，腫瘤細(xì)胞的增殖彌補(bǔ)了這些細(xì)胞數(shù)量的減少

本研究構(gòu)建的3D生物打印組織中的細(xì)胞存活率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷降低而后恢復(fù)到75%左右，該值低于網(wǎng)格肝癌組織中的細(xì)胞存活率(約90%)，但與Amann等構(gòu)建的3D細(xì)胞培養(yǎng)體系中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型的細(xì)胞存活率(60%~80%)相近，造成該結(jié)果的原因可能是本研究采用的同心環(huán)結(jié)構(gòu)缺乏3D生物打印組織內(nèi)的通道，從而導(dǎo)致中樞缺氧。缺氧是大多數(shù)實(shí)體腫瘤的共同顯著特征，也被發(fā)現(xiàn)與膽囊癌預(yù)后不良有關(guān)。在模型中還發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)特征的上調(diào)，表明TME恢復(fù)得更好。此外，在3D四培養(yǎng)模型中觀(guān)察細(xì)胞增殖能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)大量GBC-SD細(xì)胞呈Ki-67陽(yáng)性。在多細(xì)胞組織中，成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以被標(biāo)記。加入VEGF和bFGF后，內(nèi)皮細(xì)胞中CD31表達(dá)強(qiáng)烈。這表明多細(xì)胞四培養(yǎng)方案是成功的，各種細(xì)胞均存活。

通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序，成功在3D四培養(yǎng)模型中鑒定了上皮細(xì)胞(GBC-SD細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、巨噬細(xì)胞(分化的THP-1)和成纖維細(xì)胞(CCC-ESF-1)。這四種細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)比例與最初的設(shè)計(jì)有所不同，可能是因?yàn)镚BC細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)增殖，而某些基質(zhì)細(xì)胞在長(zhǎng)期四培養(yǎng)中可能面臨的挑戰(zhàn)，例如PMA誘導(dǎo)的THP-1分化會(huì)阻止增殖。因此，在GBC 3D四培養(yǎng)模型中，第7天分化的THP-1細(xì)胞的相對(duì)百分比較低。利用3D四培養(yǎng)模型，鑒定了兩種不同的GBC細(xì)胞簇，它們具有明顯不同的基因表達(dá)譜和不同的標(biāo)志富集特征。這兩簇被描述為鱗狀上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞。這些結(jié)果表明，在多細(xì)胞四培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。這表明3D四培養(yǎng)模型有效地復(fù)制了腫瘤內(nèi)細(xì)胞的多樣性和異質(zhì)性，這可能歸因于模型內(nèi)GBC-SD 細(xì)胞的差異空間排列及其與基質(zhì)細(xì)胞以及ECM的相互作用。

為了進(jìn)一步評(píng)估這些生物打印組織中的TME，對(duì)來(lái)自3D四培養(yǎng)模型、3D單元培養(yǎng)模型和2D模型的幾組不同細(xì)胞類(lèi)型的RNA進(jìn)行了測(cè)序。這三種模型中的GBC細(xì)胞表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜。GSVA結(jié)果證實(shí)，在3D四培養(yǎng)模型中，TME內(nèi)的機(jī)械生態(tài)位、代謝微環(huán)境、免疫微環(huán)境和應(yīng)激適應(yīng)微環(huán)境對(duì)腫瘤進(jìn)展有顯著影響。對(duì)DEG的進(jìn)一步探索表明，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用可能與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、上皮細(xì)胞遷移和鈣離子隔離調(diào)節(jié)相關(guān)的途徑有關(guān)。同時(shí)，3D生物打印引入的腫瘤細(xì)胞-ECM相互作用可能與GO術(shù)語(yǔ)有關(guān)，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明3D四培養(yǎng)模型可能比其他體外模型代表更惡性和臨床相關(guān)的表型。利用PANCAN隊(duì)列的生存分析進(jìn)一步證實(shí)，3D四培養(yǎng)特征評(píng)分高的患者預(yù)后較差。

越來(lái)越多的研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞間相互作用以及細(xì)胞-ECM相互作用在腫瘤研究中的重要性。傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)和動(dòng)物模型存在局限性。因此，該領(lǐng)域迫切需要更好的體外腫瘤模型。

五、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了體外可長(zhǎng)期存活的多細(xì)胞成分的3D生物打印膽囊癌組織。首先，我們的GBC 3D四培養(yǎng)模型是一種具有空間異質(zhì)性的體外模型，由GBC細(xì)胞核心和非腫瘤性腫瘤周?chē)M織組成。該模型可以更精確地表示TME，并可作為強(qiáng)大的研究平臺(tái)。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，應(yīng)用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建這些模型具有顯著的效率和令人滿(mǎn)意的可重復(fù)性，使模型中的各種細(xì)胞類(lèi)型能夠在保持其生物功能的同時(shí)承受長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)。此外，GBC細(xì)胞(被鑒定為鱗狀上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞)在3D四培養(yǎng)模型中表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。此外，基因表達(dá)譜顯示，與傳統(tǒng)的體外模型相比，3D四培養(yǎng)模型更好地刺激了腫瘤組織的生物學(xué)行為，并提示了更惡性的腫瘤表型。該模型有望在未來(lái)腫瘤生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

六、參考文獻(xiàn)

Jin Y, Zhang J, Xing J, Li Y, Yang H, Ouyang L, Fang Z, Sun L, Jin B, Huang P, Yang H, Du S, Sang X, Mao Y. Multicellular 3D bioprinted human gallbladder carcinoma forin vitromimicry of tumor microenvironment and intratumoral heterogeneity. Biofabrication. 2024 Aug 22;16(4). doi: 10.1088/1758-5090/ad6d8c. PMID: 39121870.